山葡萄籽中原花青素提取工藝優(yōu)化

王新偉，趙 瀅，沈育杰*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 吉林 132109)

山葡萄籽中原花青素提取工藝優(yōu)化

王新偉，趙 瀅，沈育杰*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 吉林 132109)

目的：通過單因素與正交試驗(yàn)研究不同的提取溫度、料液比、時(shí)間、溶劑體積分?jǐn)?shù)等因素對原花青素提取率的影響，確定最佳提取工藝參數(shù)。方法：以山葡萄籽為原料，乙醇作為提取劑，通過香草醛-HPLC法測定提取物中原花青素的提取率，香草醛法測定黃烷—3—醇單體與原花青素的總含量，HPLC法測定黃烷—3—醇單體的含量，二者之差為原花青素總含量。結(jié)果：最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間120min、提取溫度60℃、料液比1:5(g/mL)。結(jié)論：在此工藝參數(shù)下，原花青素提取率為3.12%。

山葡萄籽；原花青素；提?。幌悴萑?；高效液相色譜法(HPLC)

原花青素為植物中一大類酚類物質(zhì)的統(tǒng)稱[1]，廣泛存在于各種植物中，因在熱酸性條件下能轉(zhuǎn)化成花青素而得名[2]，它是由兒茶素或表兒茶素單體以C4-C6或C4-C8連接而成，結(jié)構(gòu)中富含活潑羥基[3]，具有很強(qiáng)的抗氧化能力[4]，目前原花青素已廣泛應(yīng)用于食品[5]、藥品[6]、化妝品[7]和保健品[8]等行業(yè)和領(lǐng)域。

山葡萄(Vitis amurensis Rupr)，又名東北山葡萄，主產(chǎn)于中國東北，俄羅斯遠(yuǎn)東和朝鮮等地區(qū)[9]山葡萄籽是目前已知原花青素最為豐富的資源[10]，其所含的黃酮類物質(zhì)是歐亞種葡萄的4倍左右[11]。

吉林省是我國山葡萄酒的主產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量在20萬噸左右，山葡萄籽作為釀酒副產(chǎn)物主要被當(dāng)做廢棄物，既造成資源浪費(fèi)又帶來環(huán)境污染。本實(shí)驗(yàn)對從山葡萄籽中提取原花青素的工藝進(jìn)行研究，具有很大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山葡萄籽 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所；原花青素標(biāo)品、兒茶素標(biāo)品、表兒茶素標(biāo)品、沒食子酸標(biāo)品、表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)品 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；香草醛(分析純) 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙醇(分析純)、甲醇(分析純)、乙酸(分析純) 北京化工廠；鹽酸(分析純) 煙臺雙雙化工有限公司；乙腈(色譜純) 美國Honey Well公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80型粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；IOTAVATO12-124型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Buchi公司；HWS-24型恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；HZF-211型真空干燥箱 上海弘越實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2450型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；1200型高效液相色譜儀器(DAD檢測器) 美國安捷倫公司。

1.3 原花青素制備與檢測

1.3.1 原花青素制備

山葡萄籽粉脫脂，將干燥山葡萄籽粉碎后，按料液比1:3(g/mL)加入石油醚密封，間歇振蕩，48h后抽濾，通風(fēng)脫去殘留石油醚。脫脂山葡萄籽粉置于三角瓶中密封，按照一定料液比加入提取劑，水浴加熱，間歇振蕩一定時(shí)間后，抽濾除去殘?jiān)?，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸濃縮后置于真空干燥箱中干燥得到原花青素粗品。

1.3.2 原花青素的含量測定方法

采用香草醛-濃鹽酸法檢測原花青素與黃烷－3－醇單體的總含量，HPLC法測定黃烷－3－醇單體的含量，在實(shí)際操作中以沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯4種單體來代表黃烷－3－類單體[12]的總含量，二者之差為原花青素含量。

式中：C為吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的樣品的質(zhì)量濃度；n為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；W為樣品定容以后的體積；Tp為脫脂葡萄籽粉末中原花青素的含量。

1.3.2.1 香草醛-濃鹽酸法

顯色劑配制：精確稱量1.00g香草醛，8mL濃鹽酸用甲醇定容于200mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。將原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.00、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40mg/mL的甲醇溶液，取1mL標(biāo)品溶液與5mL顯色劑立即混勻，在30℃避光反應(yīng)30min，以甲醇做空白對照，于波長500nm處測量吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.8839x－0.0223，R2=0.99792。

將原花青素粗品用甲醇稀釋1000倍后按上述方法測定原花青素與單體的總含量。

1.3.2.2 HPLC法測定單體含量

色譜條件：色譜柱Angilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；保護(hù)柱：Angilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×12.5mm，5μm)。DAD檢測器，波長280nm，流速0.8mL/min，柱溫30℃。流動相A：1%乙酸；流動相B：乙腈-水-乙酸(80:19:1)。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 HPLC elution program

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別將沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)品溶解于甲醇中，配制成質(zhì)量濃度分別為0.50、0.40、0.30、0.20、0.10mg/mL的溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后依次進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示。

表2 4種單體標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of 4 mono-phenols

將原花青素粗品甲醇稀釋溶液用0.45μ m微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，測定4種單體總的含量。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 粉碎度的影響

山葡萄籽分別粉碎成10、20、30、40、50目后脫脂，精確稱量5份質(zhì)量為5.00g的山葡萄籽粉末，1:7的料液比分別加入到60%的乙醇溶液，50℃提取80min，測定提取率。

1.4.2 提取溫度的影響

精確稱量5份質(zhì)量為5.00g的脫脂山葡萄籽粉，1:7的料液比加入60%的乙醇溶液中，分別置于溫度為40、50、60、70、80℃，的水浴中提取80min，測定提取率。

1.4.3 提取劑體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

精確稱量5份質(zhì)量為5.00g的脫脂山葡萄籽粉末，1:7的料液比分別加入到體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液中，50℃水浴加熱80min測定提取率。

1.4.4 料液比對提取率的影響

精確稱量5份質(zhì)量為5.00g的山葡萄籽粉分別加入到料液比為1:4、1:5、1:6、1:7、1:8的60%乙醇溶液，于50℃中反應(yīng)80min測定提取率。

1.4.5 提取時(shí)間對提取率的影響

分別稱取5份質(zhì)量為5.00g脫脂山葡萄籽粉，1:7的料液比加入60%的乙醇溶液，50℃水浴中反應(yīng)60、80、100、120、140min后測定提取率。

1.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對原花青素提取率影響最大的4個(gè)因素——提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最優(yōu)化的提取方案，試驗(yàn)結(jié)果用SAS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對山葡萄籽中原花青素提取率的影響

2.1.1 粉碎度對提取率的影響

圖1 粉碎度對提取率的影響Fig.1 Effect of particle size of crushed Amur grape seeds on extraction rate of proanthicyanidins

由圖1可知，山葡萄籽的粉碎度在20目時(shí)提取率最高，隨著粉碎度的進(jìn)一步增大，提取率呈下降的趨勢，這是因?yàn)樵诜鬯檫^程中產(chǎn)生大量的熱將部分原花青素氧化分解，另一方面粉碎度越高山葡萄籽中所含多糖，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分析出也越多[13]，造成提取物的純度下降的同時(shí)還會導(dǎo)致溶液黏稠度上升，給后續(xù)的抽濾帶來很大困難，加大了后續(xù)工作的難度，綜上所述，山葡萄籽最適宜粉碎度為20目。

2.1.2 提取溫度對提取率的影響

圖2 提取溫度對提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of proanthicyanidins

由圖2可知，隨著溫度的上升，提取率也隨之增大，在60℃達(dá)到最大值且趨于平衡，隨著溫度進(jìn)一步升高，提取率呈下降趨勢，這因?yàn)樵ㄇ嗨卦诟邷匾妆谎趸?，溫度越高原花青素的結(jié)構(gòu)越容易被破壞，活性成分損失很大，還會造成雜質(zhì)析出過多影響產(chǎn)品純度[14]，因此提取溫度不宜超過70℃。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，原花青素的提取率也逐漸升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最大值，隨后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取率呈下降趨勢，這是因?yàn)樗谌軇┲衅鸬酱┩讣?xì)胞壁的作用，在提取過程中有利于原花青素的析出，若溶劑中含水量過低時(shí)溶劑對細(xì)胞壁的穿透作用下降導(dǎo)致提取率下降，因此最佳體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of proanthicyanidins

2.1.4 料液比對提取率的影響

圖4 料液比對提取率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of proanthicyanidins

由圖4可知，隨著料液比的減小原花青素提取率逐漸增加，在料液比為1:6時(shí)達(dá)到最大值，隨后提取率呈穩(wěn)定的趨勢，說明此時(shí)原花青素已經(jīng)接近析出完全，繼續(xù)減小料液比會造成后續(xù)步驟加壓蒸餾時(shí)間的延長和溶劑的浪費(fèi)，因此最佳料液比為1:6。

2.1.5 提取時(shí)間對提取率的影響

圖5 提取時(shí)間對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of proanthicyanidins

由圖5可知，提取率隨時(shí)間的延長逐漸增加，在100min時(shí)原花青素浸出率達(dá)到最大值，以后趨于穩(wěn)定并逐漸下降，原因是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，原花青素被空氣中的氧氣氧化從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過分析極差(表3、4)得知，各因素對原花青素提取率大小的影響分別為C＞B＞A＞D，最佳提取方案為溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、時(shí)間為120min、料液比為1:5。

表3 山葡萄籽中提取原花青素提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal tests for optimizing the extraction process of proanthicyanidins

表4 山葡萄籽中提取原花青素提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Results of orthogonal tests for optimizing the extraction process of proanthicyanidins

通過方差分析(表5)可知，4個(gè)因素的差異性非常顯著，證明結(jié)果可靠，確定最佳提取工藝為溫度60℃、體積分?jǐn)?shù)70%、時(shí)間120min、料液比1:5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis

圖6 樣品色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of proanthicyanidins extract from Amur grape seeds

精確稱取3份質(zhì)量為5.00g的脫脂山葡萄籽粉末，按照上述優(yōu)化條件進(jìn)行提取，原花青素提取率為3.12%，4種單體的總含量為0.52%，樣品色譜圖如圖6所示。

其中沒食子酸與表兒茶素沒食子酸酯的含量為4種單體總含量的3.8%，葡萄籽提取物中，沒食子酸與表兒茶素沒食子酸酯的含量為4%～5%[15]。

3 結(jié) 論

對山葡萄種子提取物中黃烷－3－醇單體的色譜洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化選擇，摸索出的流動相條件可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)單體物質(zhì)的完全分離，為從山葡萄籽中進(jìn)一步分離其他單體活性成分提供了基礎(chǔ)。

通過正交試驗(yàn)確定山葡萄籽中原花青素的最佳提取工藝為提取溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1:5(g/mL)、提取時(shí)間120min，原花青素提取率為3.12%，單體提取率為0.52%。

葡萄籽中提取純化原花青素的工藝技術(shù)已經(jīng)成熟，山葡萄籽的開發(fā)和利用目前處于起步階段，下一步的研究的方向應(yīng)集中于對山葡萄籽提取物種的原花青素成分進(jìn)行進(jìn)一步的純化研究以提高產(chǎn)品的純度。

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Optimization of Extraction Process for Proanthicyanidins from Amur Grape Seeds

WANG Xin-wei，ZHAO Ying，SHEN Yu-jie*
(Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Jinlin 132109, China)

Objective: To investigate the effects of temperature, time and ethanol concentration and material/liquid ratio on proanthicyanidins extraction from Amur grape seeds through single-factor and orthogonal tests and to explore the optimal extraction process. Methods: Ethanol was used for the extraction of proanthicyanidins. The total content of flavan-3-ol monomers and proanthicyanidins (both of them can be simultaneously extracted by ethanol) was determined by vanillin method,and the method used to determine the content of flavan-3-ol monomers was HPLC. Thus, the content of proanthicyanidins could be calculated as the difference between the two determined values. Results: The optimal extraction process conditions were extraction temperature of 60 ℃, ethanol concentration of 70%, extraction time of 120 min and material/liquid ratio of 1:5 (g/mL).Conclusion: Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of proanthicyanidins from Amur grape seeds was up to 3.12%.

Amur grape seeds；proanthocyanidins；extraction；vanillin；HPLC

S663.1

A

1002-6630(2011)10-0021-04

2010-08-13

農(nóng)業(yè)部作物種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目(NB2010-2130135-36)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(nycytx-30-01)

王新偉(1983—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)植物種質(zhì)資源評價(jià)與利用。E-mail：nhkswxw@126.com

*通信作者：沈育杰(1951—)，男，研究員，本科，研究方向?yàn)榭购咸延N和種質(zhì)資源收集保護(hù)。E-mail：tcssyj@126.com