荔枝肉水溶性多糖提取工藝優(yōu)化

張 鐘，唐緒明，張 玲

(廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東 茂名 525000)

荔枝肉水溶性多糖提取工藝優(yōu)化

張 鐘，唐緒明，張 玲

(廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東 茂名 525000)

目的：以荔枝肉為原料，采用水溶劑提取技術(shù)從荔枝肉中提取水溶性多糖。方法：在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗分析方法優(yōu)化水溶劑提取荔枝肉水溶性多糖的最佳工藝參數(shù)，并對多糖含量進(jìn)行測定。結(jié)果：水溶劑提取的最佳工藝參數(shù)為荔枝肉與水的比例1:17(g/mL)、提取溫度90.5℃、提取時間4.0h。此時的響應(yīng)值即提取率達(dá)到10.06%。提取所得的粗多糖，用苯酚-硫酸法對其含量進(jìn)行測定，結(jié)果多糖平均含量為6.71%。結(jié)論：響應(yīng)面法優(yōu)化荔枝肉多糖提取工藝參數(shù)是可行的。

荔枝肉；水溶性多糖；提??；工藝參數(shù)優(yōu)化

多糖是20多個單糖的聚合體，包括植物多糖、動物多糖和微生物多糖[1]，目前，已從天然物質(zhì)中分離出來300多種多糖。從19世紀(jì)60年代，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)了多糖的生理活性[2]，包括抗凝血[3-4]、抗感染[5]、抗腫瘤[6-7]。

關(guān)于荔枝多糖提取方法的報道較少，已報道的提取方法主要有傳統(tǒng)的熱水浸提法、微波提取以及超聲波提取[8-10]。多糖是極性大分子化合物，大多采用不同溫度的水，稀堿溶液提取。但是由于酸和堿易引起糖苷鍵的斷裂而造成多糖的得率降低。故本實驗采用熱水浸提荔枝多糖，在浸提參數(shù)中溫度、固液比和時間均影響多糖的浸提率，要根據(jù)需要選擇最佳的工藝參數(shù)。同時對荔枝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是由Box等[11]于20世紀(jì)50年代提出的一套統(tǒng)計方法。響應(yīng)面分析法用于確定各因素及其交互作用在加工過程中對非獨立變量的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法[12-13]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、生物工程、食品工程等方面[14]。R S M中較有代表性的方法是響應(yīng)面回歸(response surface regression，RSR)優(yōu)化程序，RSR的原理是用一個多元回歸方程(回歸函數(shù))擬合多因子與試驗結(jié)果(響應(yīng)值)之間的關(guān)系，各因子與響應(yīng)值之間的顯著程度用方差分析驗證從而確定該分析結(jié)果的可信度[15]。RSM軟件結(jié)合Graph2等繪圖軟件還能夠給出參數(shù)與響應(yīng)值之間的平面圖和立體圖，直觀地提供局部參數(shù)值和整體響應(yīng)面值之間的對應(yīng)關(guān)系，從而獲得明確有用的結(jié)論[16]。

本實驗選用熱水作提取溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面試驗分析法對荔枝多糖的熱水浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以最大限度提高荔枝多糖提取率，以期為后續(xù)研究提供參考，為荔枝多糖的開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

荔枝干(黑葉) 自制。從茂名官渡市場購買新鮮黑葉荔枝，去掉枝葉和病、爛、裂果，用100℃熱水燙30s，撈起瀝干水后置60℃恒溫干燥箱中干燥，貯存?zhèn)溆谩?/p>

葡萄糖、8 0%苯酚、濃硫酸、無水乙醇、9 5%乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚(以上試劑均為分析純)、活性炭、木瓜蛋白酶。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-D蘇泊爾攪拌機 浙江蘇泊爾炊具股份有限公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機廠；722型紫外-可見分光光度計 上海第三分析儀器廠；FA1140電子天平 上海天平儀器廠；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械；TDL-5離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 荔枝肉水溶性多糖的提取工藝流程

荔枝干→除去殼、核→60℃熱水浸泡20min→攪拌機打漿→在熱水浴中浸提→浸提液趁熱過濾→濾液冷卻→離心去渣(5000r/min，15min)→真空濃縮至原體積1/4→用無水乙醇調(diào)至溶液乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%→置冰箱12h→離心(5000r/min，10min)→沉淀依次用適量80%乙醇、95%乙醇洗滌兩遍→恒溫箱中干燥至質(zhì)量恒定→荔枝粗多糖

1.2.2 水溶劑提取的條件

1.2.2.1 多糖的提取率計算

1.2.2.2 水溶劑浸提料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的荔枝干肉5.0g，稱取5組，每組3份，打漿，在70℃條件下，分別以料液比1:5、1:8、1:11、1:14、1:17、1:20(g/mL)浸提 3h。根據(jù)多糖的提取率確定水溶劑浸提最佳料液比。

1.2.2.3 水溶劑浸提時間的選擇實驗

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的荔枝干肉5.0g，稱取5組，每組3份，打漿，加熱提取的料液比根據(jù)上一實驗確定，分別浸提2、3、4、5、6 h，溫度是7 0℃。根據(jù)多糖的提取率確定水溶劑浸提最佳浸提時間。

1.2.2.4 水溶劑加熱浸提溫度的選擇實驗

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的荔枝干肉5.0g，稱取5組，每組3份，打漿，加熱提取的料液比和浸提時間根據(jù)上一實驗確定，分別在溫度是60、70、80、90、100℃進(jìn)行浸提。根據(jù)多糖的提取率確定水溶劑浸提最佳溫度。

1.2.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

綜合單因素試驗給出的信息，以提取溫度，時間，料液比作為試驗因素，運用SAS 6.1軟件程序根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法(簡稱RSM)，以荔枝粗多糖提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等高線圖，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.3 多糖含量的測定方法

采用苯酚-硫酸法：苯酚-硫酸試劑可與游離的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起顯色反應(yīng)，己糖在波長490nm處(戊糖及糖醛酸在波長480nm)有最大吸收，吸收度與含量呈線性關(guān)系。

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20mg，置于500mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，配成0.04mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，置于具塞試管中，各以蒸餾水補充至2.0mL，然后加入6%重蒸酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，靜止10min，搖勻，室溫放置20min后于波長490nm處測吸光度，以2.0mL水按同樣顯色操作作為空白，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，再以吸光度(A)對葡萄糖質(zhì)量濃度(C)做回歸處理，得回歸方程：A=0.0632C＋0.008(r=0.9959)。

1.3.2 樣品中荔枝多糖的含量測定

1.3.2.1 樣品溶液的制備

將荔枝干肉剪碎，精密稱取1.9986g，用體積分?jǐn)?shù)80%的酒精浸泡過夜，濾去廢酒精，然后于索氏提取器中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%新酒精回流4h，殘渣揮去溶劑后，加17倍的蒸餾水，于98℃浸提3.5h，浸提液趁熱過濾，用蒸餾水反復(fù)洗濾渣至250mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻備用。

1.3.2.2 樣品中荔枝多糖含量的測定

精密吸取1.3.2.1節(jié)所得樣品溶液0.4mL于具塞試管中，按1.3.1節(jié)的方法測定吸光度(A)，由回歸方程計算供試液中葡萄糖濃度(C)，按下式計算樣品中荔枝多糖含量。

式中：C為供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度/(μg/mL)；D為多糖的稀釋因子；m為供試?yán)笾悠返馁|(zhì)量/μg；f為換算因子(經(jīng)實驗測定黑葉荔枝多糖f值為2.252[9])。

多糖的稀釋因子D的計算：荔枝干碎肉經(jīng)提取后，用蒸餾水反復(fù)洗濾渣至250mL容量瓶中定容，然后取出0.4mL，接著以蒸餾水補充至2.0mL，然后加入6%重蒸酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，所以D為5000。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶劑提取條件的確定

2.1.1 水溶劑浸提料液比

圖1 料液比對粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖1可以看出，料液比小于1:17時，隨著料液的增大，荔枝肉粗多糖的提取率也隨著提高；但料液比超過1:17后，粗多糖提取率略有下降，可能是由于料液比增大，在減壓濃縮時多糖容易降解，導(dǎo)致最終算出的提取率下降。因此，料液比選1:17為佳。

2.1.2 水溶劑浸提時間

圖2 浸提時間對提取率的影響Fig.2 Effect of soaking time on extraction rate of polysaccharides

由圖2可以看出，浸提時間小于4h時，隨著浸提時間的增加，荔枝肉粗多糖的提取率也隨之提高，但當(dāng)浸提時間大于4h后，隨著浸提時間的增加，粗多糖的提取率反而緩慢下降。在4h后隨著浸提時間的延長，提取率總體呈下降趨勢，部分原因可能是由于浸提時間過長，降低了某些反應(yīng)的活化能，使多糖分子之間、多糖分子與其他分子之間形成新的作用力，增加分子之間碰撞機會，阻止多糖分子溶出；也可能是由于蛋白變性沉淀后包裹在果肉顆粒表面，導(dǎo)致多糖浸出率下降。因此，浸提時間以4 h為佳。

2.1.3 水溶劑浸提溫度

圖3 不同浸提溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖3可以看出，浸提溫度小于90℃時，隨著浸提溫度的提高，荔枝肉粗多糖的提取率隨之提高；但當(dāng)浸提溫度大于90℃后，隨著浸提溫度的提高，粗多糖的提取率略有所下降，因此浸提溫度選90℃為宜。

2.2 水溶劑提取多糖響應(yīng)面試驗

RSM試驗采用二次旋轉(zhuǎn)設(shè)計得到15個組合試驗點，測定每次試驗中的結(jié)果獲得相應(yīng)的響應(yīng)面值見表2。將表2響應(yīng)面值輸入計算機，經(jīng)RSM回歸擬合后，得到對X1、X2、X3的回歸方程：

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 回歸系數(shù)取值及分析結(jié)果Table 4 Regression coefficients and their significance in the fitted regression model

用SAS軟件對該多元回歸方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3、4。

從表3、4可看出，二次回歸模型的F值為6.690，P＜0.05，大于在0.05水平上的F值，而失擬項的F值為0.549，P＞0.05，小于0.05水平的F值，該模型的R2=0.9233，說明該模型擬和結(jié)果好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該試驗的理論預(yù)測。X1和X12交互作用在0.01水平上對多糖提取有極顯著作用，X1和X12在0.05水平上對多糖提取率作用顯著。

為了觀察某兩個因素同時對多糖提取率的影響，對表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，觀察在其他因素條件固定不變的情況下，某兩因素對多糖提取率的影響，經(jīng)SAS分析，所得的響應(yīng)面及其等高線圖見圖4。

響應(yīng)曲面圖是響應(yīng)值在各試驗因子交互作用下得到的，構(gòu)成一個三維空間曲面。從圖4可以看出，3個因素的交互作用對響應(yīng)值的影響情況，等高線圖越陡峭表示因素的效應(yīng)越大，能揭示出各因素對多糖提取率影響的顯著性。同時，可以看出各交互因素的最佳作用點基本都落在試驗范圍之內(nèi)，經(jīng)SAS軟件優(yōu)化后的各因素最佳試驗組合為浸提溫度90.5℃、浸提時間4.0h、料液比1:17。三因素的顯著程度為：提取溫度＞浸提時間＞料液比。此時的響應(yīng)值即提取率達(dá)到10.06%。

圖4 各兩因素交互作用對提取率的影響Fig.4 Response surface and contour of any two factors on extraction rate of polysaccharides

唐小俊等[8]用熱水提取荔枝多糖，采用正交試驗優(yōu)化出的提取時間是4h，浸提溫度是100℃，而本實驗溶劑提取法中采用RSR試驗優(yōu)化出的提取時間為4h，浸提溫度是90.5℃，比采用正交試驗優(yōu)化出的浸提溫度也降低了。

2.3 荔枝多糖的計算

本實驗測得黑葉荔枝肉中平均多糖含量為6.71%，RSD為0.47%，說明本測定誤差小(表5)。

表5 荔枝(黒葉)多糖含量的計算結(jié)果Table 5 The content of polysaccharide in litchi flesh

3 結(jié) 論

采用水溶劑提取技術(shù)從荔枝肉中提取水溶性多糖，在水溶劑提取荔枝肉水溶性多糖的單因素試驗基礎(chǔ)上，再通過響應(yīng)面試驗分析方法優(yōu)化了水溶劑提取荔枝肉水溶性多糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：水溶劑提取的最佳工藝參數(shù)為荔枝肉與水的比例1:17(g/mL)、提取溫度90.5℃、提取時間4.0h。三因素的顯著程度為提取溫度＞浸提時間＞料液比。本實驗用苯酚-硫酸法測定荔枝多糖，測得黑葉荔枝肉中多糖含量為6.71%，RSD為0.47%，說明本測定誤差小，測定結(jié)果精確。

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Process Optimization for Extraction of Water-soluble Polysaccharides from Litchi Flesh

ZHANG Zhong，TANG Xu-ming，ZHANG Ling
(College of Chemistry and Life Science, Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000, China)

Objective: To explore the optimal extraction parameters for water-soluble polysaccharides from litchi flesh. Methods:A series of single-factor investigations followed by response surface analysis were carried out to optimize conditions for the extraction of water-soluble polysaccharides from litchi fresh. Sulfuric acid-phenol method was used to quantify polysaccharides.Results: The optimal extraction parameters were litchi flesh-to-water ratio of 1:17 (g/mL), extraction temperature of 90.5 ℃, and extraction time of 4.0 h. Under these conditions, the extraction rate was up to 10.06%, and the crude extract obtained showed an average polysaccharide content of 6.71%. Conclusion: It is feasible to optimize extraction parameters of water-soluble polysaccharides from litchi flesh using response surface methodology.

litchi flesh；water-soluble polysaccharides；extraction；optimal parameters

TS255.36

A

1002-6630(2011)10-0070-05

2010-07-29

廣東省高等學(xué)校人才引進(jìn)項目(201192)；茂名學(xué)院人才引進(jìn)項目(2010r2)

張鐘(1962—)，男，教授，本科，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：47108887@qq.com