聯(lián)合應(yīng)用 MLPA 技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)DMD基因單個(gè)外顯子缺失突變

莫桂玲，胡朝暉，喻長(zhǎng)順，詹益鑫，朱慶義

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne/becker muscular dystrophy，DMD/BMD）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)肌肉疾病，它是由于DMD 基因突變導(dǎo)致的X連鎖隱性致死性遺傳病，目前尚無(wú)有效的治療方法[1]。為提高檢測(cè) DMD 基因單個(gè)外顯子缺失突變的準(zhǔn)確率，避免將單個(gè)外顯子的微小突變誤判為缺失突變，為DMD 家系成員的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前基因診斷提供準(zhǔn)確的依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、PCR 技術(shù)和基因測(cè)序方法的聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)疑為DMD 基因單個(gè)外顯子缺失的樣本進(jìn)行基因診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為來(lái)自全國(guó)各醫(yī)院神經(jīng)科或兒科的患者，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 主要材料 陰性和陽(yáng)性對(duì)照品采用美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（College of American Pathologists，CAP）的DNA 質(zhì)控品。MLPA 檢測(cè)試劑盒 SALSA MLPA kit P034-A2/P035-A2 DMD/Becker 購(gòu)自荷蘭MRC-Holland公司[2-3]；DNA 提取試劑盒 QIAamp DNA blood mini kit 購(gòu)自德國(guó) Qiagen公司；GeneAmp 9700 PCR 儀和genetic analyzer 3130xl毛細(xì)管電泳儀購(gòu)自美國(guó) ABI公司；Genescan-LIZ 500 ladder 為美國(guó) ABI公司產(chǎn)品；DNA Marker（MD101-Marker I）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；ActiTaq DNA Polymerase 為德國(guó)羅氏公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及預(yù)處理 受試者安靜狀態(tài)下采集 EDTA 抗凝外周血 2～3ml。采用 QIAamp DNA blood mini kit DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量提取 DNA 在260 nm和280 nm 下的吸光度 A260和A280計(jì)算A260/A280及DNA 濃度，確保 DNA 濃度在10～50 ng 之間，冷凍保存。受試樣品共 185 例，為2009–2010年送本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 DMD 基因檢測(cè)的血樣。

1.2.2 MLPA 技術(shù)檢測(cè) 參照 MLPA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，首先進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，取1 μl PCR 產(chǎn)物與0.5 μl Genescan-LIZ 500 ladder和8.5 μl Hi-Di 甲酰胺混合，置94 ℃ 4 min，冰浴 5 min，隨后進(jìn)行毛細(xì)管電泳 1 h，溫度控制在60 ℃。每次 MLPA 檢測(cè)都包含一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（CAP2009MGL2-03）、一個(gè)空白對(duì)照、一個(gè)正常對(duì)照（CAP 2009MGL2-01）。使用 Coffalyser v9.4 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。由于DMD 基因位于X 染色體上，男性患者如果缺失一個(gè)或多個(gè)外顯子，經(jīng)MLPA 檢測(cè)將導(dǎo)致相應(yīng)外顯子產(chǎn)物缺失，即缺失外顯子的信號(hào)全部消失，重復(fù)區(qū)表現(xiàn)出信號(hào)成倍增加。女性攜帶者，相應(yīng)的外顯子缺失信號(hào)將降低35%～55%，而重復(fù)突變時(shí)相應(yīng)的信號(hào)將升高 30%～55%。

表1 DMD 基因單個(gè)外顯子的擴(kuò)增引物信息Table1 Primers information of DMD gene single exon

1.2.3 基因測(cè)序檢測(cè) 對(duì) MLPA 技術(shù)檢測(cè)到DMD 基因存在單個(gè)外顯子缺失的樣品，采用 PCR技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證。

1.2.3.1 PCR 反應(yīng) 根據(jù) GenBank 上 DMD基因序列 NC_000023.9，用 Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增 DMD 基因單個(gè)外顯子的基因序列。引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成，序列如表1。

PCR 反應(yīng)總?cè)莘e為10 μl，每一反應(yīng)體系中含10×PCR Buffer II 1.0 μl，3.2 μmol/L 上下游引物各 1.0 μl、10 mmol/L的dNTP 混合物 0.35 μl，5.6 units/μl的ActiTaq DNA Polymerase 0.07 μl，模板 DNA 1.0 μl。反應(yīng)條件為94 ℃ 12 min（94 ℃30 s，52 ℃ 或 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min；4 ℃ 保存。擴(kuò)增完成后取5.0 μl PCR 產(chǎn)物，DNA Marker 標(biāo)記，于2.0% 瓊脂糖凝膠，電壓 120 V，電泳大約 30 min，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，若顯示各上樣孔擴(kuò)增條帶清晰，結(jié)果可靠，可用于基因測(cè)序檢測(cè)。

1.2.3.2 基因測(cè)序檢測(cè) PCR 反應(yīng)體積為10 μl，分別加入 1 μl的純化 PCR 產(chǎn)物，1 μl Primer（3.2 pmol/μl），2 μl H2O，1 μl的5×Sequencing buffer和0.35 μl的BigDye Terminator v3.1。反應(yīng)條件為：96 ℃ 1 min（96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃4 min）25個(gè)循環(huán)；25 ℃ 保存。對(duì)測(cè)序 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化后，每個(gè)樣本加 10 μl的Hi-Di（甲酰胺），94 ℃ 加熱 4 min 后放置冰上 5 min，在ABI genetic analyzer 3130xl 上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。電泳結(jié)束后使用 Sequencing Analysis 5.2和Mutation Surveyor 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 MLPA 技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

在185 例樣本中，MLPA結(jié)果顯示 7 例為DMD 基因單個(gè)外顯子缺失，其信息見(jiàn)表2。以其中家系 2的697號(hào)樣本為例，其 MLPA 毛細(xì)管電泳結(jié)果及軟件分析結(jié)果如圖 1和2 所示。

2.2 PCR 及基因測(cè)序結(jié)果

2.2.1 PCR結(jié)果 根據(jù)表 2的MLPA 檢測(cè)結(jié)果，PCR 驗(yàn)證 DMD 基因外顯子是否發(fā)生缺失。其中家系 1、3、4、5、6、7結(jié)果顯示確為DMD 基因單個(gè)外顯子缺失，結(jié)果以家系 1的PCR 電泳圖（圖 3）為代表。其中家系 2結(jié)果顯示無(wú) DMD 基因單個(gè)外顯子缺失（圖 4），需要通過(guò)基因測(cè)序驗(yàn)證。

表2 樣本基本信息及MLPA、PCR 基因測(cè)序結(jié)果Table2 Basic information of the samples and results of MLPA, PCR and gene sequencing

圖1 MLPA 顯示 697號(hào)樣本“67 外顯子缺失”Figure1 MLPA result shows the 697 sample of “67 exon deletion”

2.2.2 基因測(cè)序結(jié)果 對(duì)家系 2 中的697號(hào)樣本進(jìn)行基因測(cè)序分析（圖 5和6），發(fā)現(xiàn)其存在一處插入突變（c.9760_9781dupTTTGGGGGCAGTAA CATTGAGC），引起框移突變（p.Pro3261LeufsX5）。

3 討論

DMD 基因突變的形式多樣，其中缺失突變占 55%～65%，重復(fù)突變占 5%～10%，其他微小突變約占 25%～30%[4]。目前，國(guó)內(nèi)常用的檢測(cè) DMD 基因缺失/重復(fù)突變的技術(shù)有：southern blot、多重 PCR 技術(shù)、MLPA 技術(shù)、變性高效液相色譜技術(shù)（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）、DNA 微陣列技術(shù)等[5]。由于southern blot 雜交法耗時(shí)、工作量大，迅速被多重 PCR 法替換，后者能檢測(cè)到覆蓋 DMD 基因18個(gè)外顯子所發(fā)生的突變，能檢測(cè)到 DMD 基因的缺失熱區(qū)，但不能覆蓋 DMD 基因的79個(gè)外顯子，不能檢測(cè)到雜合缺失，也不能檢測(cè)重復(fù)突變。MLPA 技術(shù)是后來(lái)出現(xiàn)的一種比多重 PCR 法更為先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，能檢測(cè)發(fā)生在所有 79個(gè)外顯子的缺失/重復(fù)突變，同時(shí)也可檢測(cè)雜合型缺失/重復(fù)突變[6-7]。檢測(cè) DMD 基因微小突變的技術(shù)有：依賴(lài)于使用 RNA的體外蛋白截短實(shí)驗(yàn)（protein truncation test，PTT）、編碼序列直接測(cè)序法、使用基因組的變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、異源二聚體分析、變性高效液相色譜等方法[5]，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但比較適合實(shí)驗(yàn)室使用的是直接測(cè)序法。聯(lián)合使用 MLPA 技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)，可以檢測(cè)到絕大多數(shù) DMD 基因突變。

圖2 MLPA 軟件分析顯示 697號(hào)樣本 67 外顯子缺失Figure2 MLPA of the software analysis showed that 697 sample is the 67 exon deletion

圖3 家系 1的PCR 電泳圖Figure3 The electrophoresis result of family 1

圖4 家系 2的PCR 電泳圖Figure4 The electrophoresis result of family 2

圖5 697號(hào)樣本 DMD 基因 67號(hào)外顯子的測(cè)序結(jié)果Figure5 The 67 exon sequencing result of 697 sample

圖6 697號(hào)樣本 DMD 基因 67號(hào)外顯子突變序列與探針連接序列Figure6 The repeat sequence and probe ligation sequence of DMD gene exon 67

MLPA 技術(shù)在DMD 檢測(cè)中的應(yīng)用主要針對(duì)大片段的缺失和重復(fù)突變。通常，DMD 基因缺失突變涉及多個(gè)相鄰的外顯子，少數(shù)可表現(xiàn)出單個(gè)外顯子的“缺失”。實(shí)際上，MLPA 檢測(cè)到的DMD 基因單個(gè)外顯子缺失可分成兩種情形：①真正的缺失突變；②探針結(jié)合區(qū)的微小突變。

當(dāng)使用 MLPA 技術(shù)檢測(cè)到 DMD 基因存在單個(gè)外顯子缺失時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室用 PCR 技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)來(lái)驗(yàn)證，以提高檢測(cè)單個(gè)外顯子缺失的準(zhǔn)確率，避免將單個(gè)外顯子的微小突變誤判為缺失突變。本文家系 2 中的697號(hào)樣本，微小的插入突變（c.9760_9781dupTTTGGGGGCAGTAACATTGA GC）剛好發(fā)生在探針連接點(diǎn)（AGTAACATTG-A GCCAAGTGT）上[2]（圖 6），從而影響了探針與模板的結(jié)合，導(dǎo)致最后67號(hào)外顯子對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物大大降低，造成 67號(hào)外顯子缺失的假陽(yáng)性結(jié)果[8]。通過(guò) PCR 技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)，證實(shí)其是 67號(hào)外顯子的微小突變。

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[3]SALSA MLPA kit P035 DMD mix 2.Holland: 2000 (2010-05-24)[2011-8-24].http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormProductDetails.aspx?Tag=tz2fAPIAupKyMjaDFE 9bmuxqlhe/Lgqfk8Hkjuss|&Prod uctOID=CwGDaIKqVKc|.

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