竇房結(jié)細(xì)胞自律性與超極化激活起搏電流關(guān)系的研究進(jìn)展

汪艷麗(綜述)，劉如秀(審校)

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院心內(nèi)科，北京100053)

心臟的最高起搏點(diǎn)為竇房結(jié)，竇房結(jié)細(xì)胞的自律性決定心率的快慢，竇房結(jié)細(xì)胞的自律性受到很多因素影響，其中最主要的是超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道及其產(chǎn)生的電流，現(xiàn)對(duì)近年來(lái)對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞自律性與該通道及電流的關(guān)系研究進(jìn)展予以綜述。

1 竇房結(jié)細(xì)胞的自律性

心臟的自律性來(lái)源于特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)的自律細(xì)胞，其中竇房結(jié)細(xì)胞的自律性最高，稱(chēng)為起搏細(xì)胞，是正常的起搏點(diǎn)。竇房結(jié)細(xì)胞屬慢反應(yīng)電位的節(jié)律性活動(dòng)細(xì)胞，其動(dòng)作電位幅度小，靜息電位也小，動(dòng)作電位中沒(méi)有平臺(tái)，只有0、3、4期，4期不穩(wěn)定，在復(fù)極完畢后，就自動(dòng)、緩慢地除極，使膜電位逐漸減小，即4期自動(dòng)除極。當(dāng)除極達(dá)到閾電位水平(約－40 mV)時(shí)即可暴發(fā)動(dòng)作電位，因此，4期自動(dòng)除極是形成竇房結(jié)細(xì)胞自律性的基礎(chǔ)。該除極化過(guò)程是通過(guò)細(xì)胞膜上各種離子流的參與實(shí)現(xiàn)的［1］。

經(jīng)典的電生理理論認(rèn)為參與竇房結(jié)細(xì)胞4期自動(dòng)除極的離子流包括超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子電流(起搏電流，簡(jiǎn)稱(chēng)If)、延遲整流性鉀電流(Ik)、內(nèi)向鈣電流(ICa)等，其中起主要作用的是起搏電流If［2］，是竇房結(jié)起搏細(xì)胞產(chǎn)生自律性的必需離子電流，它參與竇房結(jié)細(xì)胞早期自動(dòng)化除極后1/3相，對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞自律性的產(chǎn)生起著舉足輕重的作用［3］。

2 If相關(guān)研究

If是一個(gè)被超極化所激活的、緩慢作用于舒張期電壓超極化的內(nèi)向電流，此電流具有與其他電流不相同的特性。20世紀(jì)70年代后期，Brown 等［4］首次提出了起搏電流參與引起動(dòng)作電位中的舒張期除極，其主要成分是Na+和K+，尤其是Na+的 內(nèi) 流。 DiFrancesco［5］認(rèn)為，If是竇房結(jié)細(xì)胞的主要起搏離子流，他和實(shí)驗(yàn)室的同事用2～5 mmol銫加在游離的單個(gè)竇房結(jié)細(xì)胞上阻斷If離子流可以減慢其自律活動(dòng)，用只減慢心率不降低收縮力的合成心動(dòng)過(guò)緩劑UL-FS49也有同樣效果。迷走神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿減慢心率的作用很可能是通過(guò)抑制If而實(shí)現(xiàn)，因?yàn)镮f對(duì)其十分敏感(乙酰膽堿抑制If的半最大效應(yīng)濃度僅為0.09 μmol，而它對(duì) ICa-L的抑制作用即使?jié)舛雀哌_(dá) 300 μmol也僅能降低 30% 幅值)［6］。

Barbuti等［7］通過(guò)膜片鉗技術(shù)、免疫熒光技術(shù)以及PT-PCR技術(shù)描述了小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)分化的心臟起搏細(xì)胞的If電流的分子組成和功能特性。研究發(fā)現(xiàn)If通道的阻斷劑伊伐布雷定(3 μmol)能夠阻斷50%的If電流，并使收縮頻率下降25%。通過(guò)免疫熒光方法表明，分化的起搏細(xì)胞表達(dá)超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道(hyper-polarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel，HCN)1 和 HCN4。

有研究表明缺血導(dǎo)致If的抑制。張倩等［8］的研究顯示，模擬缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)使乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞If激活曲線(xiàn)右移，并顯著增加各指令電壓下的If密度;缺血預(yù)適應(yīng)(ischemia preconditioning，IP)可抑制 I/R增強(qiáng) If作用，有助于維護(hù)I/R時(shí)竇房結(jié)細(xì)胞電生理活動(dòng)的相對(duì)穩(wěn)定性。在對(duì)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)(hypoxic preconditioning，HP)的研究中，缺氧/復(fù)氧使竇房結(jié)細(xì)胞If激活曲線(xiàn)右移，并顯著增加各指令電壓下的If密度;而HP和Diazoxide預(yù)處理均能明顯減輕缺氧/復(fù)氧對(duì)If的影響，使If回復(fù)到接近正常對(duì)照水平。缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的竇房結(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載可能是引起If幅值增大，激活曲線(xiàn)右移的重要原因，而HP及Diazoxide對(duì)If的作用也很可能與減輕缺氧/復(fù)氧引起的Ca2+超載有關(guān)。

3 竇房結(jié)細(xì)胞If相關(guān)離子通道

3.1 通道結(jié)構(gòu)與分型 編碼產(chǎn)生If電流的HCN家族有4種亞型:HCN1～4。每一種亞型都含有6個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域(cyclic nucleotidebinding domain，CNBD)。HCN通道在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似電壓依賴(lài)性的鉀通道，為4個(gè)亞基形成的四聚體，每個(gè)亞基包括6個(gè)跨膜螺旋片段(S1～6)，其中S4片段帶正電荷起電壓傳感器作用，介于S5與S6之間有一個(gè)離子傳導(dǎo)孔區(qū)域即P區(qū)，對(duì)鉀和鈉離子有通透性，在C端有環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)CNBD，能與環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)結(jié)合而調(diào)節(jié)HCN通道的電壓依賴(lài)性。該區(qū)與其他幾種環(huán)核苷酸結(jié)合蛋白(如cAMP激活的蛋白激酶、CNG通道)序列高度相似。HCN通道家族在從S1區(qū)到CNBD之間的核心區(qū)域都是高度保守的(有80%～90%的序列相同)，兩端區(qū)域的變異性較大，具有較低的同源性［9］。

HCN的4中基因亞型在哺乳動(dòng)物中被成功克隆，在哺乳動(dòng)物的心臟組織中四種基因亞型均被發(fā)現(xiàn)，在心臟中HCN1、HCN2和HCN4是主要的亞型，負(fù)責(zé)形成If［10］，主要的HCN 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是HCN4。人和其他動(dòng)物竇房結(jié)表達(dá)很高水平的 HCN，HCN mRNA［11］在兔竇房結(jié)是浦肯野細(xì)胞的40倍，是心室肌工作細(xì)胞的140倍。兔竇房結(jié)HCN4可占HCN mRNA表達(dá)的4/5，HCN4剔除大鼠在出生前就死亡，但胚胎顯示有嚴(yán)重的心動(dòng)過(guò)緩，心臟If下降85%［12］。對(duì)動(dòng)物心臟胚胎發(fā)育的研究表明，在胚胎心臟發(fā)育的早期，心室肌細(xì)胞仍維持較高的自律性，隨著發(fā)育的成熟，心室肌細(xì)胞HCN基因的表達(dá)水平逐漸下降，其中HCN4的下降更為明顯，最終使心室肌細(xì)胞喪失自律性?；蛱蕹难芯恳脖砻鳎琀CN4基因全部缺失的小鼠由于不能形成“成熟”的起搏動(dòng)作電位而不能存活，而部分缺失的小鼠心臟竇房結(jié)的自發(fā)搏動(dòng)頻率顯著下降超過(guò)50%［13］。這說(shuō)明HCN4基因不僅在竇房結(jié)起搏細(xì)胞的自發(fā)電活動(dòng)中起著主要的作用，而且對(duì)心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的功能發(fā)育也起著非常重要的作用。

竇房結(jié)細(xì)胞HCN4表達(dá)的異常與竇房結(jié)功能紊亂密切相關(guān)［14］，某些心律失常的發(fā)生可能與竇房結(jié)急性I/R損傷后，竇房結(jié)細(xì)胞HCN4表達(dá)減低，其主導(dǎo)的起搏電流 If異常有關(guān)［1］，付勇等［15］研究 I/R 損傷對(duì)在體兔竇房結(jié)細(xì)胞影響中發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)急性I/R損傷對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞HCN4表達(dá)量改變有影響，缺血時(shí)間越長(zhǎng)，再灌注損傷越重。通過(guò)上調(diào)起搏電流If，可提高竇房結(jié)細(xì)胞自律性，以緩解緩慢性心律失常［16］。

3.2 通道特性 HCN 通道具有以下特性［9，17-21］:①由超極化電位激活。If激活閾值－40～－50 mV，正好是竇房結(jié)細(xì)胞舒張除極期間，最大激活電位在－100 mV、完全激活的電流/電壓關(guān)系曲線(xiàn)顯示反轉(zhuǎn)電位在－10～－20 mV之間。②對(duì)K+和Na+的通透性。If電流是在正常生理?xiàng)l件下含有鈉和鉀離子的混合性正離子流，其相對(duì)通透比率為0.24～0.31。最近有研究發(fā)現(xiàn)，HCN通道對(duì)鈣離子有通透性。在靜息電位水平通道激活的結(jié)果是形成一個(gè)主要由Na+攜帶的凈內(nèi)向電流，它可使膜發(fā)生除極而接近AP啟動(dòng)的閾電位。③可以被Cs+以電壓依賴(lài)性方式阻斷。2 mmol/L的Cs+可以幾乎完全可以阻滯該電流。④可被細(xì)胞內(nèi)側(cè)的cAMP上調(diào)。cAMP與通道蛋白耦聯(lián)，促進(jìn)通道激活的動(dòng)力學(xué)過(guò)程并改變其對(duì)正性電壓的電壓依賴(lài)性激活特性，cAMP增加時(shí)If通道開(kāi)放速率增快。⑤它的單通道電導(dǎo)微弱，在細(xì)胞外鉀離子濃度升高的情況下If的電導(dǎo)僅為1 pS，分布密度低，開(kāi)放速度慢。If對(duì)胞外鉀離子非常敏感，鉀離子降到正常水平之下(2～4 mmol/L)即可引起電流幅度的顯著降低。If對(duì)鉀離子敏感有其生理學(xué)意義，比如，當(dāng)心肌缺血時(shí)，If增大可改變心肌興奮性。

3.3 通道在竇房結(jié)細(xì)胞自律性調(diào)節(jié)中的作用 自主神經(jīng)刺激可改變If通道的電壓依賴(lài)性，那么，自主神經(jīng)遞質(zhì)是如何調(diào)節(jié)If的?通常認(rèn)為，β-腎上腺能激動(dòng)劑對(duì)心臟的正性變時(shí)作用是通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶提高胞內(nèi)cAMP水平，因此早期研究中曾提出cAMP作為第二信使調(diào)節(jié)If的假說(shuō)。cAMP的這種直接作用就像自主神經(jīng)遞質(zhì)的作用一樣，并不改變If的最大激活電流，結(jié)果是改變舒張期除極的斜率和心率。通過(guò)胞內(nèi)cAMP與If通道的直接作用而不是依賴(lài)于磷酸化作用，If激活曲線(xiàn)向正電壓方向移動(dòng)使舒張期的If內(nèi)向電流增加，因而增大了舒張期去極化的斜率而使心率加快。

膽堿能激動(dòng)劑通過(guò)對(duì)If的相反效應(yīng)而負(fù)向移動(dòng)激活曲線(xiàn)使舒張期的If內(nèi)向電流減少，因而降低了舒張期除極的斜率而使心率減慢。兒茶酚胺和乙酰膽堿對(duì)If的作用在自主神經(jīng)調(diào)節(jié)心率中起重要的作用。If通道是第一個(gè)可同時(shí)被電壓、電壓門(mén)控、cAMP結(jié)合、環(huán)腺苷酸門(mén)控等調(diào)節(jié)的例子［17，22，23］。

蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是公認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，有多種生物活性，能使通道蛋白磷酸化，從而控制離子流變化［24］。在心肌細(xì)胞上，PKA可接受細(xì)胞膜上α及β腎上腺素受體激動(dòng)等上游信號(hào)，本身被激活并通過(guò)磷酸化改變細(xì)胞膜上通道蛋白的構(gòu)象，從而影響離子通道的門(mén)控動(dòng)力學(xué)，最終改變通道電流［25］。

Huang等［26］很早就發(fā)現(xiàn)，心臟β腎上腺素受體能通過(guò)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)離子通道來(lái)增加心率。但其分子機(jī)制尚未被很好地了解，過(guò)去認(rèn)為β腎上腺素引起起搏電流興奮性的調(diào)節(jié)通過(guò)cAMP和HCN4的直接連接，而不依賴(lài)于HCN4的磷酸化而實(shí)現(xiàn)，然而最近研究發(fā)現(xiàn)If興奮調(diào)節(jié)中需要PKA的活性，PKA能直接磷酸化HCN4，If被認(rèn)為是竇房結(jié)細(xì)胞 cAMP 信號(hào)的作用靶點(diǎn)［27］。Liao 等［28］等研究證明了PKA能夠調(diào)節(jié)竇房結(jié)細(xì)胞HCN4通道。PKA抑制劑能明顯降低β腎上腺素受體激動(dòng)劑對(duì)鼠離體SNC電壓依賴(lài)性If的改變。PKA也能使異源表達(dá)的HCN4通道電壓依賴(lài)性向更正的電位改變。離體實(shí)驗(yàn)揭示PKA能夠直接磷酸化HCN4上至少13個(gè)位點(diǎn)，包括N端至少3個(gè)殘基和C端至少10個(gè)殘基。被丙氨酸取代和截?cái)嗟腍CN4通道蛋白的功能分析確定了PKA調(diào)節(jié)位點(diǎn)在HCN4的C末端，這是PKA調(diào)節(jié)If所需要的，證明了HCN4通道可以被PKA所調(diào)控。因此，蛋白激酶A可直接對(duì)HCN4進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)節(jié)竇房結(jié)細(xì)胞的自律性。Lin等［29］等研究表明，HCN4通道可以被酪氨酸激酶磷酸化，酪氨酸磷酸化在HCN通道的調(diào)節(jié)中起著重要作用。酪氨酸磷酸化的增強(qiáng)或減弱可以導(dǎo)致HCN4表達(dá)的改變，其增強(qiáng)能提高竇房結(jié)細(xì)胞起搏電流的活動(dòng)。

4 結(jié)語(yǔ)

If在心臟起搏活動(dòng)中起著重要的作用，是保證心臟的節(jié)律性和規(guī)則性跳動(dòng)、心臟正常生理功能的前提，If的失衡可能是各種心律失常相關(guān)疾病發(fā)生的離子基礎(chǔ)之一，而If通道蛋白HCN4磷酸化水平的異常則可能是其分子基礎(chǔ)之一，并受蛋白激酶A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)控If達(dá)到對(duì)心臟起搏激動(dòng)和節(jié)律調(diào)控作用，近年HCN通道的研究引起生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的重視，以期通過(guò)對(duì)該通道及If的研究，應(yīng)用于心律失常疾病的治療，使If及其通道蛋白成為藥物的主要作用靶點(diǎn)。

［1］Stieber J，Hofmann F，Ludwig A.Pacemaker channels and sinus node arrhythmia［J］.Trends Cardiovasc Med，2004，14(1):23-28.

［2］Yerra L，Reddy PC.Effects of electromagnetic interference on implanted cardiac devices and their management［J］.Cardiol Rev，2007，15(6):304-309.

［3］Barbuti A，Difrancesco D.Control of cardiac rate by"funny"channels in health and disease［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，1123:213-223.

［4］Brown HF，Difrancesco D，Nobel SJ.How dose adrenaline accelerate the heart?［J］.Nature，1979，280(5719):235-236.

［5］DiFrancesco D.The pacemaker current(If)Plays an important role in regulating SA node pacemaker activity［J］.Cardiovasc Res，1995，30(2):307-308.

［6］Zaza A，Robinson RB，DiFrancesco D.Basal response of the L-type Ca2+and hyperpolarized activated currents to autonomic agents in the rabbit S-A node［J］.J Physiol，1996，491:347-350.

［7］Barbuti A，Crespi A，Capilupo D，et al.Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，46(3):343-351.

［8］張倩，宋治遠(yuǎn)，仝識(shí)非.線(xiàn)粒體KATP通道開(kāi)放劑與缺氧預(yù)適應(yīng)對(duì)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞起搏離子流作用的比較［J］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22(10):1909-1912.

［9］Accili EA，Proenza C，Baruseotti M，et al.From funny current to HCN channels:20 years of excitation［J］.News Physiol Sci，2002，17(2):32-37.

［10］Dobrzynski H，Boyett MR，Anderson RH.New insights into pacemaker activity:promoting understanding of sick sinus syndrome［J］.Circulation，2007，115(14):1921-1932.

［11］Shi W，Wymore R，Yu H，et al.Distribution and prevalence of HCN mRNA expression in cardiac tissue［J］.Circ Res，1999，85(1):1-6.

［12］李海玲，徐亞偉.與心律失常相關(guān)的microRNAs研究現(xiàn)狀［J］.國(guó)際心血管病雜志，2010，37(5):268-271.

［13］Stieber J，Herrmann S，F(xiàn)eil S.The hyperpolarization-activated channel HCN4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart［J］.Proc Nat Acadl Sci USA，2003，100(25):15235-15240.

［14］Baruscotti M，Difrancesco D.Pacemaker channels［J］.Ann N Y Acad Sci，2004，1015(5):111-121.

［15］付勇，廖斌，于風(fēng)旭，等.缺血再灌注損傷對(duì)在體兔竇房結(jié)細(xì)胞特異性通道蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2009，23(7):856-860.

［16］Verkerk AO，van Ginneken AC，Wilders R.Pacemaker activity of the human sinoatrial node:role of the hyperpolarization-activated current，I(f)［J］.Int J Cardiol，2009，132(3):318-336.

［17］Giogetti A，Carloni P，Mistrik P，et al.A homology model of the pore region of HCN channels［J］.Biophys J，2005，89(2):932-944.

［18］Yu X，Chen XW，Zhou P，et al.Calcium influx through if channels in rat ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(3):C1147-1155.

［19］Chen J，Piper DR，Sanguinetti MC.Voltage sensing and activation gating of HCN pacemaker channels［J］.Trends Cadiovasc Med，2002，12(2):42-45.

［20］Robinson RB，Siegelbaum SA.Hyperpolarization-activated cation currents:from molecules to physiological function［J］.Ann Rev Physiol，2003，65(5):453-480.

［21］Verkerk AO，Wilders R，van Borren MM，et al.Pacemaker current I(f)in the human sinoatrial node［J］.Eur Heart J，2007，28(20):2472-2478.

［22］Accili EA，Robinson RB，DiFrancesco D.Properties and modulation of If in newborn versus adult cardiac SA node［J］.Am J Physiol，1997，272(3 Pt 2):H1549-H1552.

［23］Biel M，Schneider A，Wahl C.Cardiac HCN Channels，Structure，F(xiàn)unction，and Modulation［J］.Trends Cardiovasc Med，2002，12(5):206-212.

［24］Aiello EA，Malcolm AT，Walsh MP，et al.Beta-adrenoceptor activation and PKA regulate delayed rectifier K+channels of vascular smooth muscle cells［J］.Am J Physiol，1998，275(2 Pt 2):H448-H459.

［25］Kiehn J，Karle C，Thomas D，et al.HERG potassium channel activation is shifted by phorbol esters via proteinkinase A-dependent pathways［J］.J Biol Chem，1998，273(39):25285-25291.

［26］Huang XY，Morielli AD，Peralta EG.Molecular basis of cardiac potassium channel stimulation by protein kinase A［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(2):624-628.

［27］Liao Z，St Clair JR，Larson ED，et al.Myristoylated peptides potentiate the funny current(If)in sinoatrial myocytes［J］.Channels(Austin)，2011，5(2):115-119.

［28］Liao Z，Lockhead D，Larson ED，et al.Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node［J］.J Gen Physiol，2010，136(3):247-258.

［29］Lin YC，Huang J，Kan H，et al.Rescue of a trafficking defective human pacemaker channel via a novel mechanism:roles of Src，F(xiàn)yn，and Yes tyrosine kinases［J］.J Biol Chem，2009，284(44):30433-30440.