李 鶴(綜述)，魏志平，劉彥群※(審校)

(1.泰州市人民醫(yī)院北院皮膚科，江蘇泰州225300;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇徐州221002)

黑素瘤是起源于痣細(xì)胞和黑素細(xì)胞的人類惡性腫瘤，常規(guī)放化療對其治療效果欠佳，進(jìn)展迅速，預(yù)后極差。如何使黑素瘤對化療藥物敏感、提高黑素瘤的治療有效率是當(dāng)今研究的主要目標(biāo)。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們對黑素瘤發(fā)生的分子機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識逐步加深，生物治療以其比傳統(tǒng)治療有更好的靶向性與特異性的特點成為極有發(fā)展前景的方法。當(dāng)前用于黑素瘤的生物治療方法大致有基因治療、免疫治療、針對腫瘤血供的治療等?，F(xiàn)就生物治療在黑素瘤治療中的研究和應(yīng)用予以概述。

1 基因治療

基因治療是指采用特定方式關(guān)閉、抑制異常表達(dá)基因，或通過在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來不表達(dá)或低表達(dá)的基因，達(dá)到治療疾病目的的治療方法，也就是“以基因作為靶點的治療”。黑素瘤的發(fā)生發(fā)展與多個致癌基因和抑癌基因的突變有關(guān)［1］，包括Ras信號通路中的 c-Kit、Nras、Braf、MEK、磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)等基因的高表達(dá)和PTEN基因的低表達(dá)，制約腫瘤生長的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因(CDKN2A)信號通路中抑癌基因CDKN2A的低表達(dá)，以及調(diào)控細(xì)胞凋亡的Bcl-2/p53信號通路中的基因改變。以這些突變基因為靶點的基因療法為黑素瘤的治療提供了有力的武器。

1.1 RNA干擾技術(shù)在黑素瘤基因治療中的應(yīng)用RNA干擾［2］是指由于目標(biāo)mRNA降解或翻譯抑制所引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)即含21～23個堿基的單鏈或雙鏈RNA，可以通過RNA干擾，高效、特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，促使同源mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。SiRNA主要由3種方式導(dǎo)入細(xì)胞:siRNA表達(dá)框直接導(dǎo)入、質(zhì)粒介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)。在黑素瘤的基因治療中SiRNA主要靶向于各種類型活化癌基因的mRNA。O'Connell等［3］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用siRNA沉默孤立酪氨酸激酶受體Ror2可以抑制由Wnt5A介導(dǎo)的黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Singh等［4］通過短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染剔除了A375人黑素瘤細(xì)胞CXCR1和(或)CXCR2(均為CXC趨化因子家族的CXC-8受體)的功能，體外試驗發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲潛力受到抑制;裸鼠皮下移植瘤模型在生長、增殖及微血管密度等方面顯著受抑，黑素瘤細(xì)胞凋亡顯著增加。

1.2 miRNA在黑素瘤基因治療中的作用microRNA(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNA基因先轉(zhuǎn)錄成初級產(chǎn)物(pri-miRNA)，在核內(nèi)被RNaseⅢ內(nèi)切酶家族的Drosha酶切割成70個核苷酸左右的發(fā)夾狀前體(pre-miRNA)。后者由胞核進(jìn)入胞質(zhì)，經(jīng)Dicer酶作用生成18～24 nt的雙鏈 RNA，只有其中一條鏈(成熟的 miRNA)與miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體穩(wěn)定結(jié)合形成復(fù)合物。miRNA通過與靶向mRNA的3'末端非翻譯區(qū)不完全堿基配對來調(diào)控靶mRNA降解或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯［5］。miRNA有各種不同的功能，既可以是腫瘤抑制因子也可以是癌基因。已知在黑素瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起不同作用的miRNA有:miR-137阻遏MITF表達(dá)，在黑素瘤中表達(dá)減少;miR-182過表達(dá)可使黑素瘤細(xì)胞的侵襲性增加;miR-221和miR-222可以下調(diào)c-Kit受體表達(dá)、阻遏p27基因表達(dá)，促進(jìn)黑素瘤增殖;miRNA let-7，其主要靶基因是Ras，腫瘤發(fā)生的最初機制之一就是miRNA let-7表達(dá)減少;let-7家族中的let-7b可以直接或間接地靶向細(xì)胞周期調(diào)控，從而負(fù)性調(diào)節(jié)黑素瘤細(xì)胞生長和增殖;let-7家族中的另一成員let-7a可直接阻遏整聯(lián)蛋白β3，減少黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［6］。

1.3 靶向基因-病毒治療在黑素瘤治療中的應(yīng)用靶向基因-病毒治療是由劉新垣院士最先提出的結(jié)合基因治療和病毒治療優(yōu)點的抗癌新策略［7］。攜帶治療基因的腫瘤特異性增殖腺病毒對正常細(xì)胞和組織沒有破壞作用或影響較小，只在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性的大量復(fù)制，保留了病毒殺死癌細(xì)胞的能力;同時隨著病毒的復(fù)制，抗癌基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量大大增加，進(jìn)一步提高了治療效果［7］。Zheng 等［7］將攜帶ZD55-IL-18的質(zhì)粒與含有腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞獲得重組腺病毒ZD-55-IL-18，可在黑素瘤細(xì)胞中高效表達(dá)IL-18基因，并能抑制黑素瘤細(xì)胞生長。實驗證明，靶向基因-病毒可以增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性、提高化療有效率，Jiang等［8］聯(lián)合應(yīng)用ZD55-IL-24與DTIC治療黑素瘤在體外實驗中取得了比單用更好的治療效果。令人興奮的是靶向基因-病毒還可以與RNA干擾技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，Zheng等［9］應(yīng)用荷載端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomeras ereverset ranscrip tase，hTERT)基因小干擾RNA的條件增殖型腺病毒(ZD-hTERT)在對腎癌的體內(nèi)和體外試驗中發(fā)現(xiàn)病毒特異性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，有效沉默了腎癌的hTERT基因，抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡。這提示可以聯(lián)合RNAi技術(shù)構(gòu)建與黑素瘤有關(guān)癌基因的小干擾RNA插入病毒基因組中，為黑素瘤治療提供新的思路。

2 免疫治療在黑素瘤治療中的應(yīng)用

黑素瘤的發(fā)病與免疫逃避、免疫耐受密切相關(guān)。免疫治療的目的是激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞［10］。黑素瘤免疫治療方面研究較多的主要有細(xì)胞因子治療、過繼性細(xì)胞治療及黑素瘤的疫苗治療等幾種。

2.1 細(xì)胞因子治療 干擾素α是第一個接受對轉(zhuǎn)移性黑素瘤療效評估的細(xì)胞因子，在Ⅱ期臨床試驗中有效率為5%～15%。在多個干擾素α與化療藥物合用的隨機臨床試驗中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用并不能增強對轉(zhuǎn)移性黑素瘤的療效，因而不被推薦應(yīng)用于Ⅳ期黑素瘤。目前干擾素α主要是作為佐劑用于高風(fēng)險黑素瘤的治療［11］。

IL-2是美國食品藥物管理局唯一批準(zhǔn)的用于治療Ⅳ期黑素瘤的細(xì)胞因子?？梢源龠M(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖與分化，有著廣譜的免疫增強活性，還可誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞活性，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用［12］。但因其毒性反應(yīng)嚴(yán)重［13］，IL-2只限專門治療機構(gòu)有經(jīng)驗的醫(yī)師應(yīng)用于的器官功能良好的患者身上。

IL-15和IL-21與IL-2有序列同源性，IL-15在抗IL-2中和抗體存在時刺激IL-2依賴的T細(xì)胞增殖，IL-21對CD81+T細(xì)胞和CD41+T細(xì)胞都有作用，活化的IL-21受體可使T細(xì)胞增殖、分化，還可激活細(xì)胞因子和趨化因子;IL-15和IL-21可以發(fā)揮協(xié)同作用產(chǎn)生好而持久的抗原特異的CD81+T細(xì)胞反應(yīng)［12，14］。IL-21作為單藥治療已進(jìn)入黑素瘤Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗［15，16］。

2.2 過繼性細(xì)胞治療 過繼性細(xì)胞是指經(jīng)分離、體外激活并回輸?shù)哪[瘤特異性或非特異性殺傷細(xì)胞。過繼性細(xì)胞治療繞過了機體免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的免疫耐受效應(yīng)，通過向體內(nèi)回輸經(jīng)體外擴(kuò)增活化的過繼轉(zhuǎn)移免疫細(xì)胞，靶向腫瘤進(jìn)行治療［17］。主要包括淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞過繼免疫治療和腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞過繼免疫治療。

淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞由大劑量IL-2體外活化外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生，可提高IL-2治療黑素瘤的療效［18］。腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞由腫瘤組織中分離出的T細(xì)胞在體外經(jīng)抗CD3單克隆抗體、IL-2激活產(chǎn)生。近年來，研究發(fā)現(xiàn)對腫瘤患者先進(jìn)行免疫抑制預(yù)處理，再輸給經(jīng)過體外篩選擴(kuò)增的自體腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞可明顯提高對轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療效果［19］。

2.3 黑素瘤的疫苗治療 腫瘤疫苗是直接應(yīng)用腫瘤抗原進(jìn)行主動免疫治療的一種方法，目標(biāo)是誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋細(xì)胞對抗原遞呈細(xì)胞表面人類白細(xì)胞抗原Ⅰ型分子上腫瘤抗原的識別，活化CD4+輔助 T細(xì)胞，發(fā)揮免疫記憶功能。目前Ⅲ期臨床試驗報道的黑素瘤疫苗有MSMM-1和MSMM-2的裂解物Melacine、黑素瘤相關(guān)抗原 CanVaxin、黑素瘤相關(guān)抗原vitespen和樹突狀細(xì)胞［20］。2005年2月美國食品藥物管理局批準(zhǔn)了樹突狀細(xì)胞疫苗DC-MelVac疫苗用于Ⅳ期黑素瘤患者的治療［21］。美國國立癌癥研究所外科總結(jié)了9年內(nèi)用各種不同腫瘤疫苗治療440例癌癥患者(其中黑素瘤患者422例)的情況，總客觀有效率為 2.6%［22］。

3 針對腫瘤血液供應(yīng)的治療在黑素瘤治療中的應(yīng)用

腫瘤的生長、代謝、浸潤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)均與腫瘤的血液供應(yīng)密切相關(guān)。黑素瘤獨特的血液供應(yīng)方式和多種血管生成因子的分泌是其生長迅速、轉(zhuǎn)移早、惡性度高的原因之一。

3.1 血管生成擬態(tài) 1999年 Maniotis等［23］在研究葡萄膜黑素瘤微循環(huán)時發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞通過自身變形形成可輸送血液的管道結(jié)構(gòu)，稱為血管生成擬態(tài)。該血管管道的特點是管道內(nèi)沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，腫瘤細(xì)胞模仿機體血管生成而形成瘤細(xì)胞條索并圍成管道，其中有血液流動［24］。血管生成擬態(tài)是黑素瘤在血管生成外的另一種獲得血液供應(yīng)的方式，其調(diào)節(jié)與基因、血管上皮鈣黏素、Twist1細(xì)胞核的表達(dá)等相關(guān)。血管生成擬態(tài)是預(yù)后不良的標(biāo)志，采用經(jīng)典抗血管治療聯(lián)合抗血管生成擬態(tài)治療已成為抗腫瘤治療的必要手段［25］。

3.2 血管內(nèi)皮生長因子 血管生成是黑素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其間涉及包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管抑素、纖維蛋白生長因子等在內(nèi)的多種細(xì)胞因子［26］。其中VEGF作為已知最強的血管滲透劑和內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管構(gòu)建中起重要作用［27］。Salven等［28］發(fā)現(xiàn) 32%的原發(fā)性黑素瘤表達(dá)VEGF，而在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中VEGF表達(dá)率高達(dá)91%。VEGF的主要功能包括:①促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管的形成;②增加血管通透性，引起細(xì)胞外基質(zhì)改變，為腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ);③促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞生長;④增加組織因子產(chǎn)生［27］。近年來以VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點對抗血管生成也成為黑素瘤生物治療的主要方向。Tao等［29］構(gòu)建針對VEGF的siRNA評估它對黑素瘤 A375細(xì)胞增殖和凋亡的效果，發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)下降后裸鼠移植瘤的微血管密度減少、腫瘤生長受到抑制、凋亡細(xì)胞增加。貝伐單抗是重組人源性VEGF單克隆抗體，可與人類各種VEGF高親和性結(jié)合，阻斷其介導(dǎo)的血管形成，從而有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移。目前已有貝伐單抗聯(lián)合化療藥物治療Ⅳ期黑素瘤的Ⅱ期臨床試驗，取得了比各藥物單用更好的療效［30］。

4 結(jié)語

生物治療可以針對性靶向腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的某一環(huán)節(jié)，取得了令人鼓舞的治療效果，現(xiàn)已成為繼手術(shù)、化療和放療三大經(jīng)典腫瘤治療模式后的第四模式。目前化學(xué)治療聯(lián)合多種生物治療頻繁出現(xiàn)于黑素瘤Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗中，但總體效果尚不理想，黑素瘤仍為病死率很高的腫瘤，因此，如何提高生物治療的療效及安全性仍是未來研究的重點。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，以及對黑素瘤分子機制研究的更加深入，生物治療必會成為黑素瘤綜合治療中不可缺少的組成部分。

［1］Hocker TL，Singh MK，Tsao H.Melanoma genetics and therapeutic approaches in the 21st century:moving from the benchside to the bedside［J］.J Invest Dermatol，2008，128(11):2575-2595.

［2］白愛民，賈艷敏，張曉菁.siRNA為基礎(chǔ)的RNAi在腫瘤基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，14(12):953-955.

［3］O'Connell MP，F(xiàn)iori JL，Xu M，et al.The orphan tyrosine kinase receptor，ROR2，mediates Wnt5A signaling in metastatic melanoma［J］.Oncogene，2010，29(1):34-44.

［4］Singh S，Sadanandam A，Varney ML，et al.Small interfering RNA-mediated CXCR1 or CXCR2 knock-down inhibits melanoma tumor growth and invasion［J］.Int J Cancer，2010，126(2):328-336.

［5］Filipowicz W，Bhattacharyya SN，Sonenberg N，et al.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight?［J］.Nat Rev Genet，2008，9(2):102-114.

［6］Mueller DW，Bosserhoff AK.Role of miRNAs in the progression of malignant melanoma［J］.Br J Cancer，2009，101(4):551-556.

［7］Zheng JN，Pei DS，Mao LJ，et al.Oncolytic adenovirus expressing interleukin-18 induces significant antitumor effects against melanoma in mice through inhibition of angiogenesis［J］.Cancer Gene Ther，2010，17(1):28-36.

［8］Jiang G，Liu YQ，Wei ZP，et al.Enhanced anti-tumor activity by the combination of a conditionally replicating adenovirus mediated interleukin-24 and dacarbazin e against melanoma cells via induction of apoptosis［J］.Cancer Lett，2010，294(2):220-228.

［9］Zheng JN，Pei DS，Sun FH，et al.Inhibition of renal cancer cell growth by oncolytic adenovirus armed short hairpin RNA targeting hTERT gene［J］.Cancer Biol Ther，2009，8(1):84-91.

［10］Singh R，Paterson Y.Immunoediting sculpts tumor epitopes during immunotherapy［J］.Cancer Res，2007，67(5):1887-1892.

［11］Eggermont AM，Schadendorf D.Melanoma and Immunotherapy［J］.Hematol Oncol Clin N Am，2009，23(3):547-564.

［12］Fehniger TA，Cooper MA，Caligiuri MA.Interleukin-2 and interleukin-15:immunotherapy for cancer［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2002，13(2):169-183.

［13］Tsao H，Atkins MB，Sober AJ.Management of cutaneous melanoma［J］.N Engl J Med，2004，351(9):998-1012.

［14］Davis ID，Skak K，Smyth MJ，et al.Interleukin-21 signaling:functions in cancer and autoimmunity［J］.Clin Cancer Res，2007，13(23):6926-6932.

［15］Thompson JA，Curti BD，Redman BG，et al.Phase I study of recombinant interleukin-21 in patients with metastatic melanoma and renal cell carcinoma［J］.J Clin Oncol，2008，26(16):2034-2039.

［16］Frederiksen KS，Lundsgaard D，F(xiàn)reeman JA，et al.IL-21 induces in vivo immune activation of NK cells and CD8(+)T cells in patients with metastatic melanoma and renal cell carcinoma［J］.Cancer Immunol Immunother，2008，57(12):1439-1449.

［17］Gattinoni L，Powell DJ Jr，Rosenberg SA，et al.Adoptive immunotherapy for cancer:building on success［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(3):383-393.

［18］Rosenberg SA，Lotze MT，Yang JC，et al.Prospective randomized trial of high-dose interleukin-2 alone or in conjunction with lymphokine-activated killer cells for the treatment of patients with advanced cancer［J］.J Natl Cancer Inst，1993，85(8):622-632.

［19］Dudley ME，Wunderlich JR，Yang JC，et al.Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma［J］.J Clin Oncol，2005，23(10):2346-2357.

［20］張新偉，任秀寶.黑素瘤免疫治療的研究進(jìn)展［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16(2):207-201.

［21］Banchereau J，Ueno H，Dhodapkar M，et al.Immune and clinical outcomes in patients with stage IV melanoma vaccinated with peptide-pulsed dendritic cells derived from CD34+progenitors and activated with type I interferon［J］.J Immunother，2005，28(5):505-516.

［22］Rosenberg SA，Yang JC，Restifo NP.Cancer immunotherapy:moving beyond current vaccines［J］.Nat Med，2004，10(9):909-915.

［23］Maniotis AJ，F(xiàn)olberg R，Hess A，et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and invitro:vasculogenic mimicry［J］.Am J Pathol，1999，155(3):739-752.

［24］Bissell MJ.Tumor plasticity allows vasculogenic mimicry，a novel form of angiogenic switch.Arose by any other name?［J］.Am J Pathol，1999，155(3):675-679.

［25］王丹，高青.血管生成擬態(tài)及在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(14):2143-2145.

［26］Mahabeleshwar GH，Byzova TV.Angiogenesis in melanoma［J］.Semin Oncol，2007，34(6):555-565.

［27］Kiselyov A，Balakin KV，Tkachenko SE.VEGF/VEGFR signalling as a target for inhibiting angiogenesis［J］.Expert Opin Investig Drugs，2007，16(1):83-107.

［28］Salven P，Heikkila P，Joensuu H.Enhanced expression of vascular endothelial growth factor in metastatic melanoma［J］.Br J Cancer，1997，76(7):930-934.

［29］Tao J，Tu YT，Huang CZ，et al.Inhibiting the growth of malignant melanoma by blocking the expression of vascular endothelial growth factor using an RNA interference approach［J］.Br J Dermatol，2005，153(4):715-724.

［30］Perez DG，Suman VJ，F(xiàn)itch TR，et al.Phase 2 trial of carboplatin，weekly paclitaxel，and biweekly bevacizumab in patients with unresectable stageⅣmelanoma:a North Central Cancer Treatment Group study，N047A［J］.Cancer，2009，115(1):119-127.