劉文芳，郭成金

（天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

白靈菇原生質(zhì)體制備與再生研究

劉文芳，郭成金

（天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

借助正交設(shè)計法對白靈菇原生質(zhì)體制備與再生進(jìn)行研究.結(jié)果表明，原生質(zhì)體最佳制備體系是：液體靜置培養(yǎng)7d的菌絲體，在20g／L的溶壁酶作用下，以0.6mol／L蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑，28℃酶解2h，最高制備率為1.34×107個／mL；其最佳再生體系是：以液體靜置培養(yǎng)7d的菌絲體，0.6mol／L MgSO4·7H2O為滲透壓穩(wěn)定劑，在15g／L溶壁酶與10g／L蝸牛酶作用下，34℃酶解3h，最高再生率為3.7%.

白靈菇；正交設(shè)計；原生質(zhì)體；制備；再生

白靈菇（PleurtusnebrodensisLnzenga）隸屬于真菌界、擔(dān)子菌門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，又名阿魏蘑［1－2］.白靈菇為掌狀白阿魏蘑的商品名，多生于傘形花科的草本植物上［3］.它營養(yǎng)豐富，有調(diào)節(jié)人體生理平衡、增強人體免疫功能的功效［4］.

近年來，原生質(zhì)體技術(shù)已作為研究蕈菌生理、生化、遺傳等基礎(chǔ)理論和改良菌種的一種重要方法和有效手段［5］.有學(xué)者［6－7］已用單因素實驗對白靈菇原生質(zhì)體制備及再生有一定的研究，得到了高的制備率，但再生率都不高.故作者借鑒前人［6－7］的研究，采用正交實驗系統(tǒng)地研究了白靈菇原生質(zhì)體制備與再生條件，希望得到高的再生率及優(yōu)良的再生菌株，為今后對白靈菇原生質(zhì)體融合、基因工程、發(fā)酵工程研究帶來有益的支持，為中醫(yī)藥業(yè)、食品加工業(yè)的開發(fā)利用，保健品、抗癌藥物的深層挖掘提供支持.

1 材料與方法

1.1 材料

北京房山白靈菇（PleurotusnebrodensisLnzenga）：天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蕈菌研究所保藏菌種.

綜合培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：馬鈴薯20%、棉籽皮20%、葡萄糖2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、VB10.004%、瓊脂1.6%，pH 自然［2］.

液體培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、酵母粉0.3%、蛋白胨0.2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、VB10.001%，pH 自然［8］.

RM（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：液體培養(yǎng)基＋瓊脂0.8%，以0.6mol／L甘露醇配制，對照以蒸餾水配制［9］.

1.2 方法

白靈菇菌絲體與相應(yīng)滲穩(wěn)劑混合，離心去除培養(yǎng)基，加無菌相應(yīng)酶液，在相應(yīng)溫度下酶解相應(yīng)時間；經(jīng)無菌濾網(wǎng)過濾，離心得沉淀，溶于適量滲穩(wěn)劑中，得到純化的原生質(zhì)體懸液.顯微鏡下觀察計數(shù)，計算制備率.

調(diào)整懸液濃度至105個／mL，分別取0.2mL涂布RM和對照RM，記錄再生情況，計算再生率.用L16（45）正交法分析諸因素對白靈菇原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果見表1.

表1 白靈菇原生質(zhì)體制備與再生正交實驗因素水平表Tab.1 Orthogonal experimental factors and levels for Pleurotusnebrodensis Lnzengaprotoplast preparation and regeneration

2 結(jié)果與分析

2.1 諸因素對原生質(zhì)體制備的影響

諸因素對原生質(zhì)體制備的影響見表2.據(jù)表2知：菌齡的R值最大，因此，影響白靈菇原生質(zhì)體制備率的首要因素是菌齡；分析K值之間存在的差異可確定白靈菇原生質(zhì)體制備最佳體系為7d菌齡的菌絲體，0.6mol／L蔗糖為滲穩(wěn)劑，用20g／L溶壁酶，28℃酶解2h.該體系經(jīng)3次驗證，制備率達(dá)1.34×107個／mL，見圖1.

表2 白靈菇原生質(zhì)體制備與再生正交實驗直觀分析表Tab.2 Visual analysis of orthogonal experiment scheme of Pleurotusnebrodensis Lnzengaprotoplast preparation and reparation

圖1 最佳制備條件下純化的白靈菇原生質(zhì)體（×400）Fig.1 Gained protoplasts under the optimal condition of Pleurotusferulae Lanzi（×400）

實驗發(fā)現(xiàn)，在菌齡7d時，白靈菇原生質(zhì)體的釋放方式隨著時間的變化可以同時觀察到4種釋放現(xiàn)象，見圖2.首先在菌絲頂端部位形成結(jié)構(gòu)簡單的細(xì)胞壁，原生質(zhì)體從細(xì)胞壁孔洞溢出；之后，菌絲漸漸變疏松，側(cè)壁出現(xiàn)孔洞釋放出原生質(zhì)體；當(dāng)大部分菌絲裂解成菌絲段時，在斷裂部位又釋放出原生質(zhì)體；隨著酶解時間延長，細(xì)胞壁徹底被酶解，發(fā)生質(zhì)壁分離，在內(nèi)外環(huán)境的壓力下，原生質(zhì)體從孔洞溢出，呈串珠排列在原位.原位釋放尤為明顯，這種方式釋放的原生質(zhì)體活性強，能更好地再生.整個過程在2h內(nèi)完成.

圖2 原生質(zhì)體釋放方式（原圖放大倍數(shù)均為×400）Fig.2 Protoplast release（the amplificationfactor is×400of artwork）

2.1.1 酶條件

若用15g／L溶壁酶，則酶濃度過低，破壁困難，原生質(zhì)體產(chǎn)量少，這與文獻(xiàn)［6－7］的結(jié)果不同.適當(dāng)提高酶濃度，有利于破壁.加入蝸牛酶和纖維素酶時，其成分與白靈菇菌絲細(xì)胞壁成分不吻合，不利于破壁，這與文獻(xiàn)［9］得出的結(jié)果不同，因為不同菌絲的細(xì)胞壁組成成分不同，白靈菇為側(cè)耳屬真菌，其細(xì)胞壁成分是β－葡聚糖和幾丁質(zhì)，該研究使用的溶壁酶是含有這兩種成分的復(fù)合酶，故使用20 g／L溶壁酶最佳.

2.1.2 滲穩(wěn)劑

合適的滲穩(wěn)劑濃度可使菌絲細(xì)胞保持生理狀態(tài)的內(nèi)外壓動態(tài)平衡，使原生質(zhì)體完好釋放.滲穩(wěn)劑的性質(zhì)影響酶的活性，分離白靈菇原生質(zhì)體，有機滲穩(wěn)劑比無機滲穩(wěn)劑效果要好.實驗表明：0.6 mol／L蔗糖為白靈菇原生質(zhì)體制備的最佳滲穩(wěn)劑，這與文獻(xiàn)［7］得出的結(jié)果一致.

2.1.3 酶解時間

隨著酶解時間延長，菌絲逐漸解體，釋放原生質(zhì)體的速度加快，數(shù)量增多.酶解2h時，原生質(zhì)體制備率最高；超過2h，酶活性降低，原生質(zhì)體產(chǎn)量減少.

2.1.4 酶解溫度

據(jù)表2知：28℃為白靈菇原生質(zhì)體最適宜的酶解溫度，這與李軼超等［6］得出的最佳溫度為32℃不同，但與劉玉霞等［7］的結(jié)論相同，因為超過30℃時，酶易失活，菌絲易老化，原生質(zhì)體易破裂.

2.1.5 菌齡

5d菌齡的菌絲較幼嫩，細(xì)胞壁成分簡單，極易被降解，原生質(zhì)體產(chǎn)量少，有別于文獻(xiàn)［7］，該研究增加菌齡至7d.菌齡超過7d后，菌絲細(xì)胞壁上容易沉積色素等次生物質(zhì)，酶的作用減弱，原生質(zhì)體產(chǎn)量減少，故最佳菌齡為7d.

2.2 諸因素對原生質(zhì)體再生的影響

實驗采用L16（45）正交法研究諸因素對原生質(zhì)體再生的影響.據(jù)表2知：酶條件的R′值最大，是影響白靈菇原生質(zhì)體再生的首要因素.分析K′值之間的差異，確定白靈菇原生質(zhì)體的最佳再生體系是，用7d菌齡的菌絲體，0.6mol／L MgSO4·7H2O為滲穩(wěn)劑，15g／L溶壁酶與10g／L蝸牛酶組合酶解，34℃酶解3h.經(jīng)3次驗證實驗，再生率達(dá)3.7%，高于文獻(xiàn)［6－7］，見圖3.

圖3 白靈菇原生質(zhì)體最佳再生狀況Fig.3 Pleurtusnebrodensis protoplasts regeneration

2.2.1 酶條件

實驗使用15g／L溶壁酶與10g／L蝸牛酶酶解時，原生質(zhì)體再生率最高.這與之前制備的最佳酶條件不同，因為適合原生質(zhì)體分離的酶條件，不一定適合其再生，酶濃度過高，導(dǎo)致酶解對細(xì)胞過于強烈，對原生質(zhì)體有損傷.而與文獻(xiàn)［6－7］所用的酶組合也不同，溶壁酶與蝸牛酶組合效果最佳.

2.2.2 滲穩(wěn)劑

實驗發(fā)現(xiàn)：0.6mol／L MgSO4·7H2O可促進(jìn)白靈菇原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生，形成菌絲.這不同于文獻(xiàn)［6－7］指出的甘露醇和蔗糖利于白靈菇原生質(zhì)體再生，因為對某種特定蕈菌原生質(zhì)體再生體系而言，選擇其滲穩(wěn)劑，既要考慮有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定又要兼顧有利于細(xì)胞壁形成和細(xì)胞器及超分子復(fù)合物功能的修復(fù).不同種性的大型高等真菌其細(xì)胞的滲透勢不同，所選擇的滲穩(wěn)劑也應(yīng)不同，無機滲穩(wěn)劑是否通過提供利于白靈菇原生質(zhì)體存活和再生的離子進(jìn)而促進(jìn)了白靈菇原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生還有待進(jìn)一步研究.

2.2.3 酶解時間

酶解1～2h時，大多數(shù)為菌絲片段，原生質(zhì)體數(shù)量不足，難以再生；酶解3h時，原生質(zhì)體多為非尖端菌絲細(xì)胞釋放，產(chǎn)生的原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)功能較為完整，原生質(zhì)體再生率最高.

2.2.4 酶解溫度

原生質(zhì)體再生需要一定的細(xì)胞壁殘余物作為再生引物，而酶解溫度較高時，細(xì)胞壁的合成完全，有利于再生.白靈菇原生質(zhì)體的再生率隨溫度的升高而升高，34℃時達(dá)到最高值.

2.2.5 菌齡

7d菌齡的菌絲釋放的原生質(zhì)體活性較高，基本都有核，易于再生復(fù)原；小于或大于7d菌齡則菌絲細(xì)胞或過于幼嫩或已老化，不易被酶解，因此原生質(zhì)體活力弱，再生率低.

原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上生長6～7d，形成透明突起時開始計數(shù)；7～10d時，菌落擴大，邊緣整齊，數(shù)目增加；10～15d后菌落顏色變白，數(shù)目不再增加，邊緣呈輻射狀，見圖4.

圖4 白靈菇原生質(zhì)體生長過程Fig.4 Protoplasts regeneration of Pleurotusferulae

3 結(jié)論

白靈菇原生質(zhì)體制備及再生最佳制備體系是：以7d菌齡的菌絲體，0.6mol／L蔗糖為滲穩(wěn)劑，在20g／L溶壁酶作用下，28℃酶解2h，制備率達(dá)1.34×107個／mL；最佳再生體系是：液體培養(yǎng)7d的菌絲體，0.6mol／L MgSO4·7H2O 為滲穩(wěn)劑，在15g／L溶壁酶與10g／L蝸牛酶作用下，34℃酶解3h，再生率為3.7%.得到的原生質(zhì)體再生率比前人［6－7］得到的高2倍，這將為白靈菇原生質(zhì)體技術(shù)深入研究提供有益的支持.

在原生質(zhì)體制備過程中觀察到4種釋放現(xiàn)象.

［1］ 黃年來，吳經(jīng)倫，陳忠純，等.18種珍稀美味食用菌栽培［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：17－18.

［2］ 郭成金.蕈菌生物學(xué)［M］.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2005：144－146.

［3］ 劉生學(xué).白靈菇的生物學(xué)特性及栽培技術(shù)要點［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2002（10）：34－35.

［4］ 鄭明耀.白靈菇遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 ［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006：15－17.

［5］ 楊新美.食用菌研究法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：200－217.

［6］ 李軼超，馬淑鳳，李書倩，等.白靈菇原生質(zhì)體制備與再生的研究［J］.食用菌，2006（2）：10－13.

［7］ 劉玉霞，王謙，陳瑞玲，等.白靈菇原生質(zhì)體制備及再生的研究［J］.食用菌，2009（4）：24－25.

［8］ 張長青，王紅英，張建民，等.適宜白靈菇菌絲生長條件的研究［J］.特產(chǎn)研究，2003（4）：12－14.

［9］ 郭成金，楊子美.槐耳原生質(zhì)體制備與再生研究［J］.天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，30（4）：63－66.

Study on protoplast preparation and regeneration ofPleurtusnebrodensisLnzenga

LIUWen－fang，GUOCheng－jin
（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

The conditions of preparing and regenerating ofPleurtusnebrodensisLnzengaprotoplasts were studied through orthogonal design experiments.The results showed that the optimal preparing conditions ofPleurtusnebrodensisLnzengaprotoplast were 7－day－old mycelium cultured in static liquid，using 20g／L Lywallzyme，applying 0.6 mol／L sucrose for osmotic pressure stabilizer，digesting at 28℃for 2hours.And protoplast achieved 1.34×107／ml.Protoplasts produced in the conditions of 7－day－old mycelium cultured in static liquid，applying 0.6mol／L Mg－SO4·7H2O for osmotic pressure stabilizer，using 15g／L Lywallzyme and 10g／L Snailase，digesting at 34℃for 3 hours were optimal to regeneration.And the regeneration rate was 3.7%.

PleurtusnebrodensisLnzenga；orthogonal design；protoplast；preparation；regeneration

S646.1＋4

A

1671－1114（2012）01－0088－05

2011－05－14

劉文芳（1986—），女，碩士研究生.

郭成金（1952—），男，教授，主要從事植物細(xì)胞營養(yǎng)及蕈菌生物學(xué)方面的研究.

（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）