惠 明，尚小利，田 青，張開平

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

黃曲霉（Aspergillus flavus）在自然界分布十分廣泛，用其制曲來釀造黃酒、豆醬等在中國(guó)、日本具有悠久的歷史[1]。黃曲霉群微生物包括黃曲霉、米曲霉及寄生曲霉等，部分株系在一定條件下產(chǎn)生黃曲霉毒素，對(duì)人和動(dòng)物具有很強(qiáng)的致癌作用，但有些株系不產(chǎn)毒素（如蘇-16、AS 3.800、A.flavusYA4.9等），并且能產(chǎn)生豐富的液化型淀粉酶和蛋白酶，用于麥曲、米曲制作中起糖化、蛋白分解等作用[2-3]?！耙喳溨魄们劸啤笔侵袊?guó)黃酒的特色，制曲質(zhì)量的好壞在黃酒釀造中具有極其重要的地位[4]。黃酒界有以黃曲霉制曲，因其曲種苦澀味較輕，釀酒品質(zhì)好、風(fēng)味獨(dú)特，但糖化酶活力低，因此分離和篩選高糖化酶活力的黃曲霉菌株已成為黃酒業(yè)當(dāng)務(wù)之急。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品：鎮(zhèn)平五朵山大曲、香花鎮(zhèn)散曲、安徽雙輪白酒曲、鎮(zhèn)平大曲、米曲、丹溪紅曲米、蘇州甜酒藥等；原料：馬鈴薯、麩皮、玉米粉，市售。

1.1.2 試劑

蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、瓊脂粉、可溶性淀粉生化試劑：由北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司提供；氯化鈉、脫氧膽酸鈉鹽、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、3，5-二硝基水楊酸等（分析純?cè)噭河商旖蚩泼軞W化學(xué)試劑開發(fā)中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）PDA培養(yǎng)基[5]：取新鮮馬鈴薯，去皮后稱取200g，加入1000mL水，煮沸20min后，用4層紗布過濾，清液中加入20g葡萄糖和20g瓊脂，煮沸，補(bǔ)足失水。121℃滅菌20min；（2）透明圈培養(yǎng)基[6-7]：可溶性淀粉4g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，脫氧膽酸鈉lg，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2，121℃滅菌15min；（3）孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鈉1g，硫酸鎂0.5g，1:3000孟加拉紅100mL，氯霉素0.1g，脫氧膽酸鈉1g，瓊脂粉20g，pH6.5，水1000mL，121℃滅菌15min；（4）麩皮培養(yǎng)基：稱取新鮮麩皮10g，加水12mL充分拌勻，潤(rùn)料30min后，裝于250mL三角瓶中，塞好棉塞，121℃高壓滅菌30min，取出搖瓶打散。

1.1.4 主要儀器

HZQ-Q 全溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子有限公司），UV-1100 紫外/可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)），PYX-DHS-40型恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)），YS 100 攝像顯微鏡（日本NiKon），GZX-GF-MBS-1型干燥箱（上海躍進(jìn)），JSM-6390LV型掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）等。

1.2 方法

1.2.1 分離方法

稱取各酒曲樣品1.0g，在無菌條件下分別加入裝有99mL的無菌生理鹽水和若干玻璃珠的三角瓶中，振蕩處理24h，經(jīng)無菌脫脂棉過濾后得到菌懸液，分別稀釋到10-4、10-5、10-6梯度，分別吸取100μL菌懸液涂布到孟加拉紅培養(yǎng)基上，置30℃恒溫培養(yǎng)3d～5d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

挑取生長(zhǎng)良好的疑似黃曲霉菌株，接種于透明圈培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3d，長(zhǎng)出菌落后，滴加碘液，選擇K值（透明圈直徑D與菌落直徑d的比值）大的作為初篩菌株。將初篩菌株接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，復(fù)篩，挑取平均K值較大的菌株接種于PDA斜面上，保藏備用。

1.2.2 菌株鑒定

（1）形態(tài)觀察：將保存于斜面上的疑似黃曲霉菌株接種在平板上，觀察菌落形態(tài)，并在光學(xué)顯微鏡和電鏡下觀察菌株的菌絲、頂囊和孢子的形態(tài)，查閱相關(guān)資料[8]進(jìn)行菌株鑒定。

（2）分子鑒定：特異性基因（ITS）序列由上海生工測(cè)定。

1.2.3 產(chǎn)毒分析

將斜面菌種活化后，用無菌生理鹽水洗下孢子并打散，制備孢子懸浮液，取0.5mL接種麩皮培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)40h～48h，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，間歇振蕩，防止結(jié)塊，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。種曲成熟后，倒入己消毒過的牛皮紙袋內(nèi)，搓散后放入干燥箱內(nèi)40℃通風(fēng)干燥12h，即得純種干曲。

取1g干曲加入9mL蒸餾水，在40℃水浴條件下間斷攪拌浸提1h，3000r/min離心5min得上清液試樣，送至農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心（鄭州）進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量的檢測(cè)評(píng)估，方法參考GB/T 5009.22-2003[9]。

1.2.4 產(chǎn)糖化酶性能

孢子懸浮液的制備：將保藏在斜面上的菌株活化后，用無菌生理鹽水孢子洗下并打散，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，將孢子濃度稀釋至1×106個(gè)/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：3，5-二硝基水楊酸比色定糖法[10]。取7支試管，編號(hào)，按既定量精確加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3，5-二硝基水楊酸試劑，將各試管溶液混合均勻。沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再向每管中加入適量蒸餾水，搖勻。在波長(zhǎng)520nm處測(cè)吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.5209X-0.0128（R2為0.9969）。

粗酶液的制備：稱取固體曲1g，加入19mL蒸餾水，40℃浸提1h，用脫脂棉過濾，得粗酶液。

糖化酶活力的測(cè)定：參照糖化酶GB/T 8276-2002。定義：1g 曲在40℃、pH 4.6 條件下，1h水解可溶性淀粉生成1mg葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)菌株的分離及形態(tài)觀察

利用孟加拉紅選擇性培養(yǎng)基，從8個(gè)酒曲樣品中分離得到78株曲霉菌，通過點(diǎn)種淀粉培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)糖化酶能力復(fù)篩（透明圈法），確定11株產(chǎn)糖化酶能力較強(qiáng)的菌株。對(duì)其中一株糖化酶高產(chǎn)株（編號(hào)：D-57）進(jìn)行了形態(tài)觀察（見圖1）和分子檢測(cè)。

菌株D-57生長(zhǎng)較快，菌落初呈絨狀，亮黃綠色，比較平坦，后中心微隆，慢慢變?yōu)榘稻G色，菌落表面呈顆粒狀，有放射性同心環(huán)形。光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)：菌絲無隔，頂囊呈橢圓形，頂囊表面雙層小梗，分生孢子呈光滑球形。用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黃曲霉分生孢子表面有不規(guī)則的突起、球形、粗糙，菌絲無隔，頂囊膨大成球形，雙層小梗呈放射的掃帚狀。

圖1 黃曲霉D-57菌株的分離及形態(tài)觀察Fig.1 Isolation and morphology of strain Aspergillus flavus D-57

2.2 D-57菌株的基因序列分析

測(cè)定菌株D-57的ITS序列（539bp）如下：CCTCCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCT CAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAATCGGAGG

經(jīng)GenBank（登記號(hào)：JN050281）比照，用clustal軟件做系統(tǒng)發(fā)育樹圖：

圖2 D-57菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain D-57

經(jīng)Clustal軟件分析，判定該菌株為子囊菌門，絲孢菌綱，叢梗孢目，叢梗孢科，曲霉屬，黃曲霉。

2.3 產(chǎn)毒分析

利用黃曲霉D-57菌株接種麩皮培養(yǎng)基，試制純種麩曲，樣品送往農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（鄭州）進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量的測(cè)定，依據(jù)GB/T 5009.22-2003方法檢測(cè)，樣品中黃曲霉毒素B1含量小于5μg/kg（檢驗(yàn)報(bào)告No.2011-0658）。根據(jù)我國(guó)糧食、豆類及發(fā)酵食品中黃曲霉毒素B1允許量標(biāo)準(zhǔn)（GB2761-81）規(guī)定為≤5μg/kg，因此可以認(rèn)為篩選得到的黃曲霉D-57菌株為安全菌株。

2.4 黃曲霉D-57產(chǎn)糖化酶能力分析

在麩皮培養(yǎng)基上，初步探討了黃曲霉D-57產(chǎn)糖化酶的條件。試驗(yàn)表明培養(yǎng)溫度、時(shí)間、添加玉米粉濃度等都對(duì)產(chǎn)糖化酶具有顯著影響，其中在培養(yǎng)溫度32℃、時(shí)間3d、添加玉米粉含量4%（w/w），產(chǎn)糖化酶活力（糖化力）較高，可達(dá)1015.3mg/（h·g），具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

利用孟加拉紅選擇性培養(yǎng)基，從收集到的8種傳統(tǒng)酒曲樣品中分離出70余株曲霉菌，通過透明圈水解試驗(yàn)（淀粉培養(yǎng)基）進(jìn)行復(fù)篩，確定11株目標(biāo)菌株。對(duì)其中一株水解圈較大的菌株（命名D-57）進(jìn)一步分離純化和菌種鑒定。

D-57菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，菌落表面呈顆粒狀，有放射性同心環(huán)，初期呈絨毛狀，逐漸變亮黃綠色，再到暗綠色。光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲無隔，頂囊呈橢圓形，頂囊表面有雙層小梗，分生孢子呈光滑球形，用掃描電鏡（SEM）觀察發(fā)現(xiàn)分生孢子表面有不規(guī)則的突起、球形、粗糙；分析了D-57菌株的ITS序列并結(jié)合Clustal軟件分析，認(rèn)為D-57菌株為子囊菌門，絲孢菌綱，叢梗孢目，叢梗孢科，曲霉屬，黃曲霉。

通過制麩曲檢測(cè)，黃曲霉菌株D-57不產(chǎn)黃曲霉毒素，屬于安全菌株；對(duì)其產(chǎn)糖化酶的能力進(jìn)行測(cè)試可知：在添加玉米粉4%（w/w）的麩皮培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)3d，麩曲糖化酶活力可達(dá)1015.3mg/（h·g）。

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