徐宗良 胡冬梅 劉麗

（黑龍江省完達山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150078）

前言

乳酸菌不是一個分類學上的名稱，乳酸菌是指一類以糖為原料的消耗葡萄糖50%以上，產生乳酸分解蛋白質，但不產生腐敗產物，革藍氏陽性，不形成芽孢，不運動或極少運動，過氧化氫陰性的細菌[1]。包括16個屬223個種(截止1999年12月)，主要有乳酸球菌屬;乳酸鏈球菌屬;乳桿菌屬;雙歧桿菌屬;芽孢桿菌屬。乳酸菌在自然中種類很多，分布極廣，有些生活在動物的腸、胃、口腔之中，皮膚表面以及乳、乳制品、肉類制品中；有的生存在水果、蔬菜、谷物及植物制品上，一般無致病性。它是一類重要的工業(yè)微生物，廣泛應用于輕工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)和飼料工業(yè)中。在食品和發(fā)酵工業(yè)中常用的乳酸菌主要包括乳球菌、片球菌、明串珠菌 、乳桿菌 ，雙歧桿菌 ，腸球菌、鏈球菌以及肉食桿菌等屬[2]。它們可在發(fā)酵過程中產生各種活性物質如有機酸、雙乙酰、過氧化氫、細菌素等，不僅對食品的風味有獨特的貢獻，而且可抑制腐敗菌及病原菌故有利于食品的保存。乳酸菌也是生物體內及環(huán)境中的一類重要微生物，棲息于生物體的特定部位，對于維持體內小環(huán)境尤其是腸道內正常的微生態(tài)平衡具有重要作用。大量事實證明:乳酸菌具有提高食品營養(yǎng)價值，改善食品風味，延長保存時間;對人體具有多方面的保健作用，如能調節(jié)腸道菌群，維持體內微生態(tài)平衡，抑制腸道內腐敗菌生長繁殖，消除體內有毒物質的產生，改善便秘，降低膽固醇水平，改善肝功能，緩解乳糖不耐癥，改善維生素代謝，增強免疫，抗腫瘤，抗突變等。在畜牧業(yè)方面，乳酸菌還有增膘作用。

1 乳酸菌的發(fā)現(xiàn)分離到分類體系的確立

乳酸菌的發(fā)現(xiàn)、分離到分類體系的確立，足足經過了一個世紀。

人們對微生物這一實體的認識，是從1677年列文虎克發(fā)明了顯微鏡之后。而細菌學的研究則是進入到1800年之后開始，首先是路易.巴斯德，到19世紀末，路易巴斯德和羅伯特.柯赫等人構筑了細菌學的基礎。

1857年巴斯德在研究乳酸發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)了乳酸菌，其后對于丁酸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等一連竄的研究，明白了發(fā)酵現(xiàn)象是由于特定的微生物在即使缺氧的狀態(tài)下也產生的發(fā)酵。

1878年利斯特從酸敗的牛乳中也分離了乳酸菌，同時漢森完成了啤酒酵母的純培養(yǎng)。數(shù)年之后，又發(fā)現(xiàn)了從腸道而來的雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌。當時，雖然分離了一些新的乳酸菌，但都是從實用的觀點來進行分類，一時呈混亂狀態(tài)。在這種情況下，對乳酸菌打下全般分類的基礎的是奧拉.詹森。

1919年之后，經過R.P.Tittsler、Rogosa、Sharpe及光岡等研究人員的努力，對乳酸菌的分類工作一直到60年代才趨于確立。

現(xiàn)在，在從形態(tài)學和生化學的諸性質中來進行分類之外加上了DNA同種異體、GC%和菌體脂及酸組成等化學分類，進入了分子水平階段[3]。

2 乳酸菌的生物學

乳酸菌是指以糖為原料，發(fā)酵產生大量乳酸的一類細胞。有九個屬：其中五個屬呈球狀，如乳酸球菌（Lactococcus）,迷走球菌(Vagococcus)、鏈球菌(Streptococcus ), 明串珠菌(Leuconostoc).和片球菌(Pediococcus)；四個屬呈桿狀，如肉食桿菌(Caronobacterium)、乳酸桿菌（lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobactrium）和孢子乳酸菌（Sporolactobacillus）.這些菌都和乳酸發(fā)酵有密切關系，其中乳酸桿菌和雙歧桿菌與人畜機體保健更為密切。

乳酸桿菌有44個種，連同亞種共55個種，革蘭氏陽性、無芽孢、細長、有彎曲的桿菌。有時球狀或桿狀，排列成柵或鏈狀，不液化明膠，不還原硝酸鹽，觸酶陰性能，不產色素，但菌落除白色外，偶亦有呈黃紅色者。乳酸桿菌微需氧，在5%～10%CO2環(huán)境內生長更好。生長最適溫度為30～40℃，最適pH為5.5～6.2，但到pH3.5仍然生長。同型發(fā)酵由葡萄糖主要產生乳酸，異型發(fā)酵由葡萄糖產生50%的乳酸和CO2、乙酸和乙醇。DNA的G+C含量的克分子百分比在32～53克分子%。雙歧桿菌有28個種，它也是革蘭氏陽性菌，沒有莢膜和鞭毛，多形性，有Y型或V型，有直線或彎曲的桿菌，長度為2～8um；染色不均，無芽孔、不運動，營厭氧生長。適宜生長溫度為36～38℃，初代培養(yǎng)適宜pH6.5～7.0, 在pH4.5～5.0、或8.0～8.5時不生長。葡萄糖通過果糖－6－磷酸途徑發(fā)酵，在果糖－6－磷酸激酶作用下，發(fā)酵一克分子葡萄糖生成1.5g分子醋酸和1g分子的乳酸，還產生少量甲酸、乙醇和琥珀酸，不產生丙酸和CO2。觸酶陰性，在腸道內不腐敗蛋白質內不腐敗蛋白質，不產生吲哚類化合物及有機胺，也不將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。靛基質、明膠液化，精氨酸水解為陰性。DNA的G+C含量的克分子百分比在55～67克分子%之間【4】。

3 乳酸菌的檢測方法

目前我國微生態(tài)制劑利用的益生菌近10種,其中除了乳桿菌和乳酸鏈球菌有國家的標準檢驗方法外,大部分菌種均無統(tǒng)一的標準方法,難于對該類產品進行質量控制,保證其安全性。故急需建立規(guī)范的標準檢驗方法,以便對微生態(tài)制劑進行監(jiān)督管理,保障其功能、安全性及質量,以保護消費者的健康和利益。目前國內外用于乳酸菌檢測的方法以下幾種[5,6,7]：

3.1 表型特征鑒定方法

形態(tài)和生理生化特征鑒定法 ，形態(tài)和生理生化特征鑒定是實驗室進行常規(guī)菌種鑒定中最常用和最關鍵的環(huán)節(jié)。其中,細菌顯微形態(tài)觀察指標主要有革蘭氏染色、細胞形態(tài)、運動性、是否有芽孢、鞭毛等。需要注意的是,許多乳酸菌僅憑形態(tài)和生化試驗不能準確鑒定。如雙歧桿菌屬的種間鑒別及雙歧桿菌屬與乳桿菌屬的屬間鑒別。

抗菌譜試驗分類法，各種細菌對不同抗菌藥物的敏感性不一,同一種細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也常存有差異,不過后者的差異仍有一定的范圍,對抗菌藥物的敏感性的差異程度往往顯示了不同種類細菌所具有的特征,所以這種特征可以成為細菌分類鑒定上的指征。在乳酸菌的鑒定中也是如此。

化學分類法，乳酸菌的菌體組分或代謝產物在不同種屬間存在差異,通過測定這些成分的含量,可以進行菌種鑒定。如:乳酸旋光性的測定,乳酸菌含有的醌分析,細胞壁肽聚糖組分和結構分析。目前應用于厭氧菌代謝產物的分析方法有不少, 如層析法、裂解法、氣相色譜法、離子色譜法。而應用最廣泛的是氣、液相色譜法,其中在國家標準檢驗方法的報批稿中,利用氣相色譜法對雙歧桿菌和乳酸桿菌進行屬間鑒定已成為必做項目之一。

雙歧桿菌的酶學鑒定法，雙歧桿菌是目前較常用的益生菌之一,其特征性酶的識別對于屬及種的鑒定具有重要意義。果糖-6 -磷酸鹽磷酸酮酶 , 在雙歧桿菌己糖代謝中起關鍵作用,它裂解果糖- 6 -磷酸,使雙歧桿菌發(fā)酵糖類的終產物乙酸和乳酸呈3∶2的比例。因此檢測出果糖-6 -磷酸可作為鑒定雙歧桿菌屬細菌的重要特征之一。

3.2 分子生物學及基因水平的鑒定方法

隨著科學的發(fā)展和新技術的應用,細胞學、分子生物學和遺傳學等學科的發(fā)展及其研究方法和技術對細菌分類學的滲入,使細菌分類學逐漸提高到了一個新的水平.包括聚合酶鏈式反應(PCR)方法：隨機擴增多態(tài)性DNA方法：DNA的G+C含量測定法；DNA-DNA同源性(或相關性)分析法；細菌DNA限制性核酸內切酶分析法；探針雜交法。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育學研究—rRNA同源性分析法

目前16srRNA序列同源性分析作為細菌的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關系研究已被普遍接受和廣泛應用。它揭示了現(xiàn)存物種間內在的親緣關系及其演化過程,同時也為新物種的發(fā)現(xiàn)提供了一個有力的工具。

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4 乳酸菌的生理功能

近年來乳酸菌的特殊生理活性和醫(yī)療保健功能，正日益引起各國學者和研究人員的濃厚興趣。隨著人們對乳酸菌生態(tài)學、生理學和分子生物學的深入研究，使人類能更有效地選擇和利用這些微生物，從而增進自身的健康[8]。

4.1 抑制致病菌和抗感染作用

乳酸菌在體內發(fā)酵乳糖時，產生大量乳酸、乙酸，PH值下降，腸內處于酸性環(huán)境。對致病菌，如志賀氏菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmone-lla)、大腸桿菌(Escherichia coli)、葡萄球菌(Stap-hylococcus)等致病菌有拮抗作用。低PH值有利于腸道蠕動，維持正常生理功能，阻止致病菌的定植。雙歧桿菌和某些乳桿菌產生孢外糖苷酶，可降解腸粘膜上皮細胞的復雜多糖。由于這些糖是致病菌毒素的前在受體，所以通過酶的作用，阻止致病菌毒素對上皮細胞的粘附[9]。不少乳酸菌產生細菌素，如乳酸桿菌素(Acidophilli-n)、雙歧菌素(Bifidin)等，對葡萄球菌、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、沙門氏菌、志賀氏菌有拮抗作用[10]。此外，雙歧桿菌還可將結合的膽酸分解為游離膽酸，游離膽酸對致病菌有一定作用。因此，將乳酸菌用于保健食品，以增強機體對致病菌的抵抗力，防治腹瀉、下痢、便秘，以及由于腸道紊亂引起的多種疾病。

4.2 降低血液中膽固醇的含量

血液中的膽固醇含量增高可引起心血管系統(tǒng)疾病，這是當前引起人類重視的問題之一。牛乳中膽固醇含量經乳酸菌發(fā)酵成酸牛奶后，膽固醇含量降低。經常服乳酸菌活菌劑，使血液中膽固醇下降，這可能是由于乳酸菌能抑制羥甲基戊二酸輔酶A還原酶的活性，從而降低了膽固醇含量[11]。發(fā)酵中產生的乳清酸也能起到降低膽固醇的效果。一般認為,同化作用(assimilation)和共沉淀作用(coprecipitation )是其降低膽固醇含量的兩個重要機制。Noh[12]等試驗指出嗜酸乳桿菌細胞膜可吸附膽固醇并將其同化。

4.3 降低高血壓的作用

通常認為，乳酸菌的降壓作用來自三個方面：（一）通過其胞外蛋白酶、肽酶的水解作用，將食物蛋白如乳蛋白中具有降壓活性的肽片段釋放出來，如ACE抑制肽、阿片活性肽等；（二）乳酸菌的菌體成分，如來自Lactobacillus.casei YIP9018的細胞壁的一種多糖-肽聚糖成分，在高血壓患者體內表現(xiàn)出降血壓作用。（三）部分乳酸菌、尤其是以活菌形式到達腸道的乳桿菌，在腸道內促進機體對部分可以調節(jié)血壓的礦物質的吸收。此外，部分乳酸菌產生的胞外多糖也可能具有一定的降壓作用[12]。

4.4 增強免疫功能

乳酸桿菌和雙歧桿菌一方面能明顯激活巨噬細胞的吞噬作用，另一方面由于它能在腸道定植，相當于天然自動免疫。加之它們還能刺激腹膜巨噬細胞、產生干擾素、促進細胞分裂、產生抗體及細胞免疫等[13]，所以能增強機體的非特異性和特異性免疫反應，提高機體的抗病能力。 還有研究認為乳酸菌之所以具有刺激機體產生抗體的作用，是由于菌體通過淋巴結、粘膜和C細胞刺激淋巴細胞，接受刺激的淋巴細胞再通過腸系膜淋巴結循環(huán)到血流中，并分布全身，從而調節(jié)機體的免疫應答作用。Gill和Rutherfurd【14】等人通過動物試驗證明了乳酸菌能提高免疫力。

Perdigon[13]等研究證明干酪乳桿菌能促進腸道分泌免疫球蛋白IgA,增強宿主腸粘膜的腸道粘膜反應。Lessard 和Brisson 給斷奶仔豬飼喂乳桿菌后,接種傳染性胃腸炎病毒疫苗,試驗組血清中的特異性抗體IgG水平顯著高于對照組。Alvarez等報道乳酸菌能增強消化道和呼吸道粘膜系統(tǒng)產生SIgA,進一步研究證實,乳酸菌及其代謝產物刺激動物機體的免疫系統(tǒng),其作用與免疫佐劑相似,能誘導動物一些與免疫有關的細胞產生白細胞介素、促進細胞分裂素、干擾素、腫瘤壞死因子等。

4.5 抑制腫瘤的發(fā)生,保護動物健康

自Bogdonov (1962)首次報道乳酸菌能抑制癌細胞生長以來,類似的報道很多。Golsin 等研究證明,飲用酸奶可使腸道中的葡萄糖醛酸酶、偶氮還原酶、硝基還原酶的活性降低,從而降低這些酶轉變?yōu)橹掳┪锏目赡堋riend和Shahani[15]認為,乳桿菌通過提高宿主免疫力,抑制癌的增長以及使胃腸道中致癌物失活或抑制其形成來抑制癌癥發(fā)生。

4.6 預防衰老

據研究，人體衰老與腸內菌群有關，人到老年以后，腸內莢膜桿菌產生毒胺、吲哚、氨、糞臭素、硫化氫、致癌物質和其它毒物，有害物質增加，因此，老年人糞便特別臭。人體衰老，使腸道內菌群出現(xiàn)惡化，菌群惡化會進一步加快人體衰老速度，形成惡性循環(huán)。乳酸菌能改善腸道菌群，阻止惡性循環(huán)發(fā)生，以推遲人體衰老，達到延年益壽的目的[16]。

此外，俄羅斯莫斯科大學生物系的科研人員通過實驗研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌能夠有效地抵制基因與染色體變異。俄科研人員在實驗中發(fā)現(xiàn),乳酸菌屬于能夠分離抗誘變物質(許多誘變物質能致癌)的細菌,它能分離出乳酸、醋酸和丁酸,這些酸性物質能夠消滅病原性和腐爛性細菌。實驗還證明,乳酸菌能用不同的方法消滅誘變物質。首先,它能分離出蛋白酶;其次,它能很好地抑制誘變物質的流行性。有時,乳酸菌的細胞像抗氧化劑一樣,能夠消滅自由基?？蒲腥藛T還發(fā)現(xiàn),乳酸菌和雙歧菌不僅能抑制基因突變,還具有防癌、消滅致癌物質、抑制腫瘤繼續(xù)生長的功能[17]。

5 乳酸菌應用研究

5.1 乳酸菌發(fā)酵胡蘿卜脯的研究

乳酸菌發(fā)酵胡蘿卜脯不僅保留了胡蘿卜的營養(yǎng)成分,而且增添了乳酸菌具有的有益作用。胡蘿卜經乳酸菌發(fā)酵后制成了果脯,果脯中含有的乳酸可以提高鈣、磷、鐵的利用率,促進了VD的吸收。而且產生的乳酸可使消化道的pH值下降而使腸道處于酸性環(huán)境[18]。

5.2 乳酸菌發(fā)酵香腸中的應用研究

乳酸菌在發(fā)酵香腸加工過程中始終處于優(yōu)勢菌并保持著較高水平的。較高水平的乳酸菌有效地抑制了雜菌的生長,改善了產品的品質,提高了產品的保藏性。同時發(fā)酵所營造的酸性環(huán)境和乳酸菌的促酶活性,促進了亞硝酸鹽的分解,大大降低了亞硝酸鹽的殘留量,在保持產品品質的同時,使產品的安全性進一步提高[19]。

5.3 乳酸菌在泡菜中的應用

泡菜生產是利用食鹽的高滲透作用,以乳酸發(fā)酵為主的微生物發(fā)酵過程,因此除了原料中的食鹽作為純物理化學的非生命活動外，乳酸發(fā)酵則是微生物極復雜的生命代謝活動的結果。乳酸菌對于提高泡菜的營養(yǎng)價值極為重要原料的綜合利用有著積極意義。乳酸發(fā)酵的冷加工方式對蔬菜營養(yǎng)成分，色香味體的保持極為有利，產品既有良好的感官品質，又節(jié)約能源。具有設備簡單,操作容易，成本低廉,原料豐富,食用方便等許多優(yōu)點[20]。

6 未來展望

關于乳酸菌的營養(yǎng)、保健和在疾病預防中的作用，已引起食品科學、微生物學、預防醫(yī)學和微生態(tài)學等許多學科的廣泛重視。我國是最早利用乳酸菌發(fā)酵食品的國家之一，有著豐富的傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源。在我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中，隱藏著大量未知微生物，是探索有用微生物菌株的絕好寶庫。因此，今后在繼承和開發(fā)我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的同時，應積極開展這些食品中乳酸菌的生態(tài)分布、理化特性、生理活性物質和特殊醫(yī)療保健功能方面的研究，從中選育出既有優(yōu)良發(fā)酵特性，又有特殊醫(yī)療保健功能的優(yōu)良乳酸菌，以造福人類。

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