何偉明，高 坤，周 棟，孫 偉，盛梅笑

(江蘇省中醫(yī)院 腎內科，江蘇 南京 210029)

腹膜透析是治療急慢性腎哀竭的主要腎臟替代治療方法。腹膜透析相關性腹膜纖維化是維持性腹膜透析患者常見的嚴重并發(fā)證，是導致腹膜超濾功能喪失，患者退出腹透治療的重要原因。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)轉化生長因子(Transforming growth factor beta1，TGF-β1)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase-9,MMP9)、基質金屬蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP1)等因子在腹膜纖維化的形成過程中起重要的作用[1-2]。本實驗選取不同劑量丹參干預加入脂多糖的高濃度腹透液對腹膜間皮細胞分泌TGF-β1、MMP9、TIMP1的影響，探討其可能的機制和治療價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組及給藥情況 雄性SD大鼠56只，體質量177～252 g，平均(214.34±7.17)g(由南京青龍山動物飼養(yǎng)廠提供，許可證號:SCXK-2001-0018)。所有實驗動物作適應性喂養(yǎng)1周。將大鼠隨機分為5組?？瞻捉M正常飼育，不加用任何藥物；脂多糖組每日腹腔內直接注射4.25%PD液20 mL，并在第3、5、7、9天按0.6 mg/(kg·d)加入腹透液中；丹參低劑量組每日腹腔內直接注射含丹參6 mL/L 4.25%腹透液20 mL；丹參中劑量組每日腹腔內直接注射含丹參12 mL/L 4.25%腹透液20 mL；丹參高劑量組每日腹腔內直接注射含丹參24 mL/L 4.25%腹透液20 mL，后3組在第3、5、7、9天予脂多糖(LPS)0.6 mg/kg體質量腹腔注射。

1.2 實驗用藥及試劑 4.25%腹透液，由廣州百特醫(yī)療公司提供；丹參注射液，規(guī)格10 mL/支，江蘇高郵制藥廠提供，批號991014；脂多糖，規(guī)格10 mg/支，武漢博士德生物工程有限公司；TGFB1、MMP-9、TIMP-1由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，批號：sc-6832；IL-6由北京博奧森生物技術有限公司提供。RT-PCR試劑盒為PROMEGA產品(貨號：A3500)；dNTPs(貨號：CBF4901A)；MgCl2(貨號：AB401A)；rTaq PCR聚合酶(貨號：DR100AM)；PCR DL2000 Marker(貨號：D501A)為TAKARA產品；DEPC(AMRESCO分裝，E174)；Tris-base(AMRESCO分裝，D0194)等試劑為進口分裝產品。

1.3 藥物配制 脂多糖生理鹽水稀釋0.6 mg/100 mL，混勻備用；丹參小劑量組：丹參注射液6 mL加入每升腹透液；丹參中劑量組：丹參注射液12 mL加入每升腹透液;丹參大劑量組：丹參注射液24 mL加入每升腹透液。

1.4 造模方法 注射針頭為帶鞘管的7號針頭，以左下腹靠近腹股溝中點為穿刺點,常規(guī)碘酒消毒后，針頭與腹平面呈30～45 °夾角向右腹背部進針。模型組:按脂多糖0.6 mg/kg體質量分別在實驗開始的3、5、7、9 d進行腹腔注射。藥物組：取不同濃度丹參的腹透液20 mL腹腔注射，每日1次，同時按照脂多糖0.6 mg/kg體質量分別在實驗開始的3、5、7、9 d同步進行腹腔注射。

1.5 標本留取 5組大鼠于實驗第28天，10%水合氯醛(35 mg/kg)肌注麻醉，左上腹壁避開注射部位取壁層腹膜組織、膈腹膜及腸系膜組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于常規(guī)、特殊染色及免疫組化檢測。

1.6 引物 根據網上NCBI數據庫中各自基因序列設計而獲得，序列如下，由上海博亞生物技術有限公司合成:β-actin：548 bp 上游引物：5’-GTTGTCCCTGT

ATGCCTCTG-3’ 下游引物：5’-GGAGCCAGGGCAGTA

ATCT- 3’ TGF-β1：682 bp 上游引物：5’-CTTGCTGTACTGTGTGTCCAG-3’ 下游引物：5’-TAATGGTGGACCGCAACAACG-3’ MMP-9：248 bp 上游引物：5’-TTT

TGCTCGGGCCTTAAAA-3’ 下游引物：5’-CATACTTTACGCGGACCACTT-3’ TIMP-1：310 bp 上游引物：5’-GCCATGGAGAGCCTCTGTGG-3’ 下游引物：5’-GCAGGCAGGCAAAGTGATCG-3’。

1.7 大鼠腹膜組織提取總RNA及純度鑒定 每組加入2 mL trizol試劑，組織勻漿器中勻漿后，移入1.5 mL離心管中。室溫靜置5 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min。每管加入0.2 mL氯仿，振蕩混合液15 s，室溫放置3 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。將水相轉移至一離心管內，加入等體積異丙醇，充分混勻,-20 ℃放置1 h。4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入75%乙醇1 mL，4 ℃、7 500 r/min離心5 min。超凈臺內棄乙醇上清,自然干燥，加入無酶水，輕振蕩使溶解，離心、混勻，轉入-80 ℃保存。

總RNA純度鑒定：取出各組總RNA少量，核酸蛋白定量儀(德國EPPENDORF公司，EPPENDORF)檢測各組總RNA濃度及純度，各組總RNA純度A260/280值在1.95～2.0之間。

1.8 RT-PCR反應

1.8.1 RT反應 1)取0.6 mL離心管，每管內加入隨機引物2 μL,總RNA 1.0 μg?；靹?，70 ℃孵育10 min。2)每管加樣：MgCl2(25mM)4 μL，RT 10×Buffer 2μL，dNTPs(10 mM)2 μL，RNasin Inhibiter 0.5 μL，AMV逆轉錄酶0.5 μL，加水至總體積20 μL。PCR擴增儀(英國HYBAID公司，HYBAID EXPRESS)：42 ℃1 h；95 ℃10 min；4 ℃保存。

1.8.2 PCR反應 1)25 μL PCR(β-actin)反應液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μLM，MgCl2(25 mM)2.5 μL，r Taq PCR10×Buffer 2.5 μL,上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL，r Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA第一鏈合成液5 μL，無酶水12.2 μL，總體積25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s,30個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。2)25 μL PCR(TGF-β1)反應液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μL，MgCl2(25 mM)2.5 μL，r Taq PCR10×Buffer 2.5μL,上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL，r Taq DNA聚合酶0.3 μL cDNA第一鏈合成液5 μL，無酶水12.2 μL，總體積25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94℃ 30s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃7 min；4 ℃保存。3)25 μL PCR(TIMP-1)反應液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μL，MgCl2(25 mM)2.5 μL,r Taq PCR10×Buffer 2.5 μL,上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL,r Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA第一鏈合成液15 μL，總體積25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。4)25 μL PCR(MMP-9)反應液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μL，MgCl2(25 mM)2.5 μL,r Taq PCR10×Buffer 2.5 μL，上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL，r Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA第一鏈合成液15 μL，總體積25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。

1.9 PCR產物電泳 1.6%瓊脂糖凝膠電泳：0.24 g瓊脂糖凝膠+30 mL 0.5×TBE，加熱溶解，加入EB，混勻后倒平板。Marker為PCR DL 2000(TAKARA產品)。加5.0 μL PCR擴增液(TGF-β1加8.0 μL PCR擴增液)電泳，80 V電泳40 min。Alpha Imager 2 000凝膠圖象系統(tǒng)(美國2000公司)對凝膠進行拍照、光密度數據分析。

1.10 實驗結果評估 免疫組化標記:各組指標均定位于細胞漿，以細胞漿著色呈棕黃色為陽性細胞，參照Watanabe等免疫組織化學評分標準，采用雙盲法，通過評分對它們的染色強度進行分級。根據腹膜組織中間皮細胞免疫組織化學染色的深淺和陽性細胞百分數對每個切片逐一評分，取其平均值為該片染色強度。

染色強度評分標準：陽性細胞百分數<5%、未被染色為陰性(-),5%～20%、淺棕色為弱陽性(+)，21%～50%、棕色為陽性(++)，51%～75%、深棕色為陽性(+++)，>75%、棕褐色為強陽性(++++)。為了統(tǒng)計方便，予以半定量計分：0、1、2、3、4。分別對應-、+、++、+++、++++。

2 結果

2.1 對腹膜組織TGF-β1表達的影響 見表1，圖1，表2，圖2。

表1 腹膜組織TGF-β1 mRNA(/β-actin)表達值±s,n=6)

表2 各組大鼠TGF-β1光密度積分結果±s,n=6)

2.2 對腹膜組織MMP-9表達的影響 見表3，圖3，表4，圖4，圖5。

表3 腹膜組織MMP-9 mRNA(/β-actin)表達值±s,n=6)

表4 MMP9光密度積分結果±s,n=6)

2.3 對腹膜組織TIMP-1表達的影響 見表5，圖6，表6，圖7。

表5 腹膜組織TIMP-1 mRNA(/β-actin)表達值±s,n=6)

表6 TIMP-1光密度積分結果±s,n=6)

3 討論

腹膜透析目前已經廣泛應用于終末期腎臟疾病的替代治療。隨著治療時間延長，腹膜轉運功能衰竭已成為透析技術性失敗的最重要的原因[2]。如何有效提高腹膜透析的透析效能、保護腹膜功能是當前臨床工作者所面臨的一個重大課題。丹參主要成分為丹參酮和丹參素，是重要的活血化瘀藥物，具有擴張血管、改善微循環(huán)，使血流速度加快，提高跨毛細血管超濾的作用。已有動物試驗[3]證實丹參可保護腹膜間皮層結構的完整,拮抗Ca2+內流,減弱淋巴管的收縮，從而減少了腹腔淋巴回流使凈超濾量增加。

TGF-β1是一種調節(jié)細胞生長和分化的生長因子，是膠原纖維和其他細胞外成分合成和沉積的強有力的始動因子[1]。高滲性葡萄糖刺激腹膜間皮細胞產生TGF-β1增加,呈劑量依賴性[3]。TGF-β1可以促進間質細胞如腹膜間皮細胞、成纖維細胞及成骨細胞等的增殖，不僅促進細胞外基質(ECM)成分沉積,同時又抑制其降解。TGF-β1還可通過下調組織纖溶酶原激活劑(tPA)和纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)的比例而降低機體纖溶能力[4-5]。TGF-β1誘導VEGF因子產生，腹膜新生血管生成增加，最終導致腹膜纖維化的形成,腹膜失超濾[5]。因此針對TGF-β1研究成為防治腹膜纖維化的新的治療靶點。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，丹參注射液加入腹透液中,中劑量及高劑量組均可下調TGF-β1的表達，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，從而抑制腹膜纖維化的產生。

MMPS及TIMPS的功能紊亂與ECM過多堆積密切相關,是調節(jié)ECM動態(tài)平衡的最重要的一大酶系[6]。MMPs的主要生理性抑制劑是內源性的TIMPS。TIMPS可與MMPs以非共價鍵形式生成1∶1復合物，對活性MMPS具有專一的抑制作用。MMPS和TIMPS活性的精確平衡對ECM成分的完整非常重要,二者之間的平衡共同實現(xiàn)著對膠原合成與降解穩(wěn)態(tài)的調控[7]。已發(fā)現(xiàn)20種MMPs,其中MMP-9又稱明膠酶B，主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原及層黏連蛋白、蛋白聚糖及彈性蛋白等，能降解完整的基底膜[8]，TIMP-1作為MMP-9特異性抑制物，可特異性地與相應MMP催化活性中心的鋅離子結合封閉其催化活性,阻斷其對細胞外基質的降解作用，引起細胞外基質的積聚。

本研究顯示，丹參各劑量組均可上調MMP-9 mRNA的表達(P<0.05),下調TIMP-1 mRNA的表達(P<0.05)。提示丹參能抑制TGF-β1的表達，上調MMP-9，下調TIMP-1,調節(jié)MMP-9/TMIP-1之間的平衡,干預ECM的重塑從而干預腹膜纖維化。丹參注射液對大鼠腹膜纖維化比模型組顯著減輕，其機制可能通過保護腹膜間皮細胞，抗炎、抗纖維化、抗氧自由基，并具有抑制TIMP-1表達，上調MMP9的作用[9]。

1.正常組 2.模型組 3.丹參低劑量組 4.丹參中劑量組 5.丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

1.正常組 2.模型組 3.丹參低劑量組 4.丹參中劑量組 5.丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

1.正常組 2.模型組 3.丹參低劑量組 4.丹參中劑量組 5.丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

本研究提示丹參加入腹膜透析液中具有一定的拮抗腹膜纖維化的作用。

[1]Shin GT,Kim SJ,Ma KA,et al.ACE inhibitors attenuate expression of renal transforming growth factor-beta1 in humans[J].Am J Kidney Dis,2000,36:894-902.

[2]Nakamoto H,Kawaguchi Y,Suzuki H.Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan[J].Perit Dial Int.2006,26(2):136-143.

[3]朱桂松,何勁松.中醫(yī)藥在腹膜透析相關性腹膜纖維化防治中的應用[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2008,24(5):519.

[4]池泉,黃文政,江妙津.腎素-血管緊張素系統(tǒng)與腎臟固有細胞表型轉化的關系[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2007,23(4):450-451.

[5]Medcalf JF,Walls J,Pawluczyk IZ,et al.Effects of glucose Dialysate on extracellu-lar matrix production by human peritoneal mesothelial cells (HPMC):The role of TGF-beta[J].Nephrol Dial Transplant,2001,16(9):1885-1892.

[6]Naiki Y,Maeda Y,Matsuo K,et al.Involvemene of TGFbeta signal for peritoneal sclerosing in coninuonus ambulatory peritoneal dialysisl[J].J Nephrol,2003,16(1):95-102.

[7]Shih SC,Ju M,Liu N,et al.Transforming growth factor betal induction of vascular growth factor receptor 1:Mechanism of pericyte in duced vascular suvival in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(26),15859-15864.

[8]Brew K,Dinak arpandian D,Nagase H.Tissue in hibitors of metal oproteinases:evolution,structure and function[J].Biochim Biophys Acta,2000,1477:267-283.

[9]楊振,鄭友蘭,洪鐵.丹參黃芪提取物對大鼠血管內皮損傷的保護作用[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2010,26(2):183-184.