侯素云，王宗權(quán)，賈繼明

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司技術(shù)部，河北石家莊050035）

黃芪甲苷提取物中黃芪甲苷含量測定方法比較研究

侯素云，王宗權(quán)，賈繼明

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司技術(shù)部，河北石家莊050035）

目的比較高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（high Pressure liquid chromatograPhy-evaPortive light scattering detector，HPLC-ELSD）內(nèi)標(biāo)法和柱前衍生法測定黃芪甲苷提取物中黃芪甲苷含量的差異。方法分別采用HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法和柱前衍生法測定黃芪甲苷提取物中黃芪甲苷的含量，比較2種方法對測定結(jié)果的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度及不同批次產(chǎn)品測定結(jié)果的差異。結(jié)果2種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是采用柱前衍生法測定結(jié)果的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均好于HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法。結(jié)論采用柱前衍生法測定能更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

黃芪；中草藥；色譜法，高壓液相

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯痛痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功效［1］。黃芪甲苷亦稱為黃芪皂苷Ⅳ，是從黃芪中分離得到的一種活性的皂苷類化合物，主要具有改善心肌缺血、心肌梗死、正性肌力、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用［2］。黃芪藥材及其相關(guān)的制劑都將黃芪甲苷作為含量測定的指標(biāo)，目前關(guān)于黃芪甲苷的含量測定主要是采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（high Pressure liquid chromatograPhy-evaPortive light scattering detector，HPLC-ELSD）外標(biāo)法［3-4］，很少采用HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法［5］和柱前衍生［6-7］等方法。由于蒸發(fā)光散射檢測器的重現(xiàn)性較差，因此測定黃芪甲苷的含量不夠準(zhǔn)確。本實驗對HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法及柱前衍生法進(jìn)行了比較。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996 PDA檢測器，2420蒸發(fā)光散射檢測器（Waters公司），EmPower 2色譜工作站（Waters公司），Milli-Q超純水機（美國MilliPore公司），甲醇、乙腈和四氫呋喃均為色譜純，其余的為分析純。

黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定所（批號110781-200613），人參皂苷Rb2購自中國藥品生物制品檢定所（批號111715-200802，含量以94.8%計），不同批號的黃芪甲苷提取物由河北以嶺醫(yī)藥研究院自制（利用NMR等波譜技術(shù)鑒定了化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)高效液相色譜法（high Pressure liquid chromatograPhy，HPLC）面積歸一化法檢測，純度均＞94%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

2.1.1.1 HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法對照品溶液的制備：對照品溶液的配制，精密稱取在五氧化二磷中減壓干燥至恒重的黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解配制成0.562g/L黃芪甲苷對照品溶液。內(nèi)標(biāo)溶液的配制，精密稱取人參皂苷Rb2對照品適量，加甲醇溶解配制成0.478mg/mL人參皂苷Rb2對照品溶液。

2.1.1.2 柱前衍生法對照品溶液的制備：精密稱取在五氧化二磷中減壓干燥至恒重的黃芪甲苷對照品適量，加吡啶溶解配制成0.561g/L的黃芪甲苷對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

2.1.2.1 HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法供試品溶液的制備：取黃芪甲苷提取物約12mg，精密稱定，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取1mL，置10mL量瓶中，加入1mL內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容后，搖勻，微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2.2 柱前衍生法供試品溶液的制備：取黃芪甲苷提取物12mg，精密稱定，置50mL量瓶中，用吡啶溶解并稀釋至刻度。精密吸取樣品溶液0.5mL，加入氯仿2mL，再加入苯甲酰氯0.3mL，搖勻后于冰箱中4℃放置36h，使衍生化反應(yīng)完全。揮干溶劑，殘渣用甲醇稀釋并定容至10mL量瓶中，微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件

2.2.1 HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法的色譜條件：色譜柱，ZORBAX EcliPse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm ID），流動相乙腈-水（32∶68），流速1mL/min，柱溫35℃，蒸發(fā)光散射檢測器，ELSD參數(shù)，噴霧器溫度39℃，漂移管溫度65℃，載氣壓力172.4kPa，增益值為200，進(jìn)樣體積20μL。色譜圖見圖1。

2.2.2 柱前衍生法的色譜條件：色譜柱，ZORBAX EcliPse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm ID），流動相是甲醇-水-四氫呋喃（90∶6∶4），流速1mL/min，柱溫，30℃，檢測波長，230nm，進(jìn)樣體積20μL。色譜圖見圖2。

圖1 HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法色譜圖1.人參皂苷Rb2；2.黃芪甲苷Figure 1 HPLC-ELSD chromatograms of internal standard method1.Ginsenoside Rb2；2.AstragalosideⅣ

圖2 黃芪甲苷提取物（A）及陰性樣品（B）柱前衍生HPLC-UV色譜圖*黃芪甲苷Figure 2 Precolumn derivatization HPLC-UV chromatograms of astragalosideⅣextract（A）and negative samPle（B）*AstragalosideⅣ

2.3 線性關(guān)系的考察

2.3.1 HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法線性關(guān)系考察：精密吸取黃芪甲苷對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL，分別置10mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，注入高效液相色譜儀，測得峰面積，以黃芪甲苷與人參皂苷Rb2的峰面積比y對濃度c作線性回歸，得回歸方程，y=1.284 5c+4.188 5，r=0.999 8；表明黃芪甲苷在0.028～0.281g/L內(nèi)，進(jìn)樣濃度的自然對數(shù)和峰面積比值的自然對數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 柱前衍生法線性關(guān)系考察：精密吸取黃芪甲苷對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置10mL量瓶中，用吡啶稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取對照品溶液0.5mL，加入氯仿2mL，再加入苯甲酰氯0.3mL，搖勻后于冰箱中4℃放置36h，使衍生化反應(yīng)完全。揮干溶劑，殘渣用甲醇稀釋并定容至10mL量瓶中，搖勻，注入高效液相色譜儀，測得峰面積，以黃芪甲苷的峰面積y對濃度c作線性回歸，得回歸方程，y=5.720×106c-3.736×104，r=1.000 0；表明黃芪甲苷在0.056～0.336g/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度實驗：取不同方法的同一供試品溶液，按各自方法的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，結(jié)果表明，HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法和柱前衍生法的相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.11%和0.81%。表明柱前衍生法精密度要好于HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法。

2.5 重復(fù)性實驗：取同一供試品6份，按供試品溶液制備方法制備，按各自方法的色譜條件測定，結(jié)果表明，HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法和柱前衍生法的RSD分別為2.26%和1.19%。表明柱前衍生法重復(fù)性要好于HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法。

2.6 穩(wěn)定性實驗：取同一供試品溶液，按各自方法的色譜條件分別在0、4、8、12、16、24h檢測，測定峰面積，結(jié)果表明，HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法和柱前衍生法的相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.37%和0.84%。表明柱前衍生法穩(wěn)定性要好于HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法。

2.7 加樣回收率實驗

2.7.1 HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法加樣回收率實驗：精密稱取黃芪甲苷提取物10.14mg，用甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，精密量取樣品溶液1mL，加入2mL量瓶中，共6份，分別加入濃度為0.478g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL。按照“2.1.2.1項”下制備供試品，按HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法的色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法的平均回收率為105.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.90%。

2.7.2 柱前衍生法加樣回收率實驗：精密稱取黃芪甲苷提取物13.00mg，用吡啶溶解并定容至50mL量瓶中，精密量取樣品溶液2mL，共9份，分別加入3個濃度（0.224 32、0.280 40、0.336 48g/L）對照品溶液各3份。依次用吡啶溶液定容至5mL量瓶中。按照“2.1.2.2”項下制備供試品，按柱前衍生法的色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果柱前衍生法的平均回收率為97.84%，相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.14%。表明柱前衍生法加樣回收率要好于HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法。

2.8 樣品含量測定：取3批黃芪甲苷提取物，按“2.1.2”項下方法操作制備供試品溶液。按“2.2”項下色譜方法進(jìn)行測定黃芪甲苷的含量，測定結(jié)果見表1。

表1 3批樣品中黃芪甲苷的測定結(jié)果Table 1 Determination of aStragaloSideⅣin 3 batcheS of SampleS（n=2，%）

3 討 論

3.1 衍生條件的優(yōu)化：本實驗使用苯甲酰氯進(jìn)行衍生化，在進(jìn)行衍生化時要先加入氯仿，然后再加入苯甲酰氯，這樣才能使衍生化完全。并考察了衍生化試劑的加入量、放置溫度、放置時間等，結(jié)果衍生化試劑與樣品的體積比為3∶5、放置在4℃中36h最好。

3.2 蒸發(fā)光散射檢測參數(shù)的考察：對漂移管的溫度進(jìn)行了優(yōu)化，在載氣壓力固定的條件下，溫度從50℃～80℃每隔5℃測定一次，觀察其信噪比。結(jié)果在漂移管溫度為65℃，氣體壓力為172.4 kPa的條件下，黃芪甲苷有較小的噪音值和較高的信號相應(yīng)值。

作為黃芪的標(biāo)志性成分，黃芪甲苷的最大吸收波長為20nm左右，末端吸收較弱，同時提取物中干擾組分較多，采用HPLC常規(guī)的紫外檢測器精密度準(zhǔn)確度較低。蒸發(fā)光散射檢測器檢測靈敏度高，結(jié)果比較理想［7］。但其靈敏度檢測器漂移管溫度、蒸發(fā)濕度以及霧化氣體流速等多種因素影響，儀器波動較大，相比于紫外檢測器，穩(wěn)定性和精密度較差［8-9］。特別是應(yīng)用外標(biāo)法測定時，對照品測定與樣品測定過程間儀器狀態(tài)的波動對結(jié)果準(zhǔn)確度影響較大［10］。同時蒸發(fā)光散射檢測器價值比較昂貴，應(yīng)用范圍較紫外檢測器低。本實驗比較了測定黃芪甲苷的2種方法，從實驗結(jié)果可以看出，2種方法差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，但是從2種方法的方法學(xué)考察結(jié)果表明，柱前衍生法在精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率方面都優(yōu)于HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法。并且柱前衍生法簡單易行，方法學(xué)驗證符合要求，可作為黃芪藥材及其制劑中黃芪甲苷成分定量的分析方法。

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（本文編輯：劉斯靜）

A COMPARISON OF VARIOUS METHODS IN DETERMINATION OF ASTRAGALOSIDEⅣIN THE ASTRAGALOSIDEⅣEXTRACT

HOU Suyun，WANG Zongquan，JIA Jiming
（Department of Technology，Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Company Limited Solid，Shijiazhuang 050035，China）

ObjectiveTo comPare the difference of astragalosideⅣcontent in the astragalosideⅣextract by high Pressure liquid chromatograPhy-evaPortive light scattering detector（HPLC-ELSD）internal standard method and Precolumn derivatization HPLC resPectively.MethodsThe astragalosideⅣcontent in the astragalosideⅣextract was detected by HPLC-ELSD internal standard method and Precolumn derivatization HPLC resPectively.The Precision，rePeatability，stability and accuracy of the two methods and the diversity of astragalosideⅣcontent in different batches were comPared.ResultsThe determination results of HPLC-ELSD internal standard method and Precolumn derivatization HPLC are identical statistically.But Precolumn derivatization HPLC has advantages in Precision，rePeatability，stability and accuracy.ConclusionPrecolumn derivatization HPLC can control the quality of samPle better.

astragalus membranaceus；drugs，Chinese herbal；chromatograPhy，high Pressure liquid

R284.1

A

1007-3205（2012）05-0544-04

2011-12-25；

2012-02-01

侯素云（1980-），女，山東郯城人，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司中級工程師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中藥制劑工藝研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.018