楊 浩，楊青平，查成喜，韓躍武*

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.甘肅省第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅蘭州 730000）

引入易錯(cuò)PCR和DNA-shuffling技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體庫(kù)

楊 浩1，楊青平2，查成喜1，韓躍武1*

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.甘肅省第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅蘭州 730000）

目的 引入易錯(cuò)PCR和DNA-shuffling技術(shù)構(gòu)建高庫(kù)容量的單鏈抗體庫(kù)。方法 收集不同年齡、性別、健康狀態(tài)的人的靜脈血各5 mL，提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增VH和VL基因，應(yīng)用易錯(cuò)PCR對(duì)VH和VL基因進(jìn)行突變，同時(shí)用DNA-shuffling技術(shù)對(duì)全長(zhǎng)單鏈抗體基因進(jìn)行體外改組，獲得的分子與T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，選取陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR后酶切鑒定抗體庫(kù)多樣性，計(jì)算分析單鏈抗體庫(kù)容量。結(jié)果 成功構(gòu)建了庫(kù)容量為4.37×1013的單鏈抗體庫(kù)，經(jīng)酶切鑒定，初步判定抗體庫(kù)多樣性良好。結(jié)論 引入易錯(cuò)PCR和DNA-shuffling技術(shù)，成功構(gòu)建了單鏈抗體庫(kù)，為后續(xù)篩選高親和力抗體奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

易錯(cuò)PCR;DNA-shuffling;單鏈抗體庫(kù)

*通信作者（corresponding author）:hanyuewu730000@163.com

單鏈抗體（single chain Fv，scFv）作為重要的基因工程抗體，是利用基因工程方法將抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過一段約5～25個(gè)氨基酸的連接肽（Linker）首尾拼接而形成的重組蛋白，具有很好的應(yīng)用前景。但是，目前在構(gòu)建單鏈抗體的過程中，往往因?yàn)榭贵w庫(kù)的庫(kù)容量不高導(dǎo)致篩選出的抗體的親和力較低，影響抗體的功能［1］。本研究旨在構(gòu)建高庫(kù)容量的單鏈抗體庫(kù)，為后續(xù)篩選高親和力抗體奠定基礎(chǔ)，也為構(gòu)建高庫(kù)容量核糖體展示單鏈抗體庫(kù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株及細(xì)胞系:pUCm-T載體（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），大腸桿菌E.coliDH5α（華美生物工程公司），基因型 SupE44△lacμ169（80lacZ △M15）hsdR17recAgyrA96thirelAl。

1.1.2 酶類和生化試劑:質(zhì)粒抽提試劑盒、dNTP、限制性內(nèi)切酶BstNI、DNaseI等（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），Trizol試劑、快速DNA連接及轉(zhuǎn)化試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］。

1.1.3 PCR引物設(shè)計(jì):引物設(shè)計(jì)參考V-base（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）通用引物及文獻(xiàn)［2］，用Primer Premer5.0加以適當(dāng)修改，引物合成由上海生工完成。連接肽引物:正向:5'-TCAGGTG GAGGCGGTTCTGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGA GGCTCG-3'，反向:5'-CGAGCCTCCACCGCCTGAGC CACCTCCGCCAGAACCGCCTCCACCTGA-3'，scFv 單鏈抗體引物:Cκ上游引物:5'-ACTGTGGCTGCACCA TCTG-3'，Cκ下游引物:5'-ACACTCTCCCCTGTTGAA GCT-3'，scFvf:5'-ATCGACGCTATCGCGGCCCAGCC GGCCCAGGT-3'，scFvD:5'-GCTCAGAACACTCTCCC CTGTTGAAGCT-3'，scFvU:5'-GCAGCTAATACGACT CACTATAGGAACAGACCACCATGGTCGACGCTATC GCGGCCCAGCCGGCCCAGGT-3'，易錯(cuò)PCR引物 VHep上游引物:5'-ATCGACGCTATCGCGGCCCAGCC GGCCCAGGT-3'，VHep 下游引物:5'-TCCGCCAGAA CCGCCTCCACCTGACTCGCACAGTAATACACGGC-3'，Vκep上游引物:5'-GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGC TC-3'，Vκep 下游引物:5'-CAGATGGTGCAGCCACA GTCAGGCTGCTGATTGTGAGAG-3'，Vλep 上游引物:5'-G GTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTC-3'，Vλep 下游引物:5'-CAGATGGTGCAGCCACAGTACCTAGGACG GTGACCTTGGTCCC-3'。

1.2 方法

1.2.1 人外周血淋巴細(xì)胞的分離與總RNA的提取:收集不同年齡組、不同性別及不同健康狀態(tài)的人的靜脈血各5 mL，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞。PBS洗滌分離后的外周血淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，參照Trizol試劑使用說(shuō)明，按108cells/mL Trizol的比例，提取人外周血淋巴細(xì)胞總RNA。提取后的總RNA用DEPC處理過的去離子水溶解，經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA完整性，測(cè)定濃度，用于反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 人VH、VL和Cκ基因的擴(kuò)增:以總RNA為模板，Oligo（dT）15為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈。以cDNA第1鏈為模板，以不同亞型的重鏈及輕鏈的引物分別擴(kuò)增人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。以Cκ引物擴(kuò)增人恒定區(qū)基因。VH、Vκ擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃ 5 min;變性94℃30 s，退火69℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán);延伸72℃ 10 min。Vλ擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃5 min;變性94℃ 30 s，退火66℃ 30 s，延伸72℃30 s，共30個(gè)循環(huán);延伸72℃ 10 min。Cκ擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火43℃30 s，延伸72℃ 30 s，共 30 個(gè)循環(huán);延伸72℃10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。

1.2.3 VH和VL的易錯(cuò)PCR:取適量VH和VL進(jìn)行易錯(cuò) PCR。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/L的 Taq 酶0.5 μL，10 ×易錯(cuò) PCR 緩沖液（mmol/L:Tris-HCl（pH 7.4）100、KCl 500、MgCl260、MnCl20.5，0.1%（w/v）明膠）5 μL，10 × 易錯(cuò) PCR dNTPs（mmol/L:dATP 2、dGTP 2、dCTP 10、dTTP 10）5 μL。擴(kuò)增條件同上。

1.2.4 DNA-shuffling:采用重疊延伸 PCR［3］獲得全長(zhǎng)單鏈抗體后，對(duì)單鏈抗體進(jìn)行體外改組實(shí)驗(yàn)。

1）DNaseⅠ消化改組模板

取3 μg單鏈抗體做為改組模板，于100 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行碎片化處理。體系中含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L MgCl2、0.3 U DNaseⅠ。然后16℃ 反應(yīng)15 min，100℃ 水浴加熱10 min，使DNaseⅠ失活，降解片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，回收50～100 bp片段。

2）無(wú)引物PCR

將得到的小片段產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)引物PCR，反應(yīng)體系為20 μL，體系中含 mmol/L:KCl 50、Tris-HCl 10（pH 9.0）、MgCl21.5，200 μmol/L 4 種 dNTP 和3 U Taq DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃3 min;變性94℃ 30 s，退火42℃ 30 s，延伸72℃30 s，共55個(gè)循環(huán);延伸72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

3）有引物PCR

取5 L無(wú)引物PCR獲得的產(chǎn)物，在上述相同的反應(yīng)體系中，用引物scFvU和scFvD進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 3 min;變性94℃1 min，退火60℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共 30個(gè)循環(huán);延伸72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建:用CaCl2法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用快速DNA連接及轉(zhuǎn)化試劑盒做DNA連接及轉(zhuǎn)化。37℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白篩選，獲得陽(yáng)性克隆。

1.2.6 抗體庫(kù)庫(kù)容量及多樣性分析:隨機(jī)挑取6個(gè)陽(yáng)性菌落分別放在含有20 μL 0.1%Triton X-100的離心管中，100℃、2 min水浴后，用引物 scFvU和scFvD進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件同前，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)相應(yīng)擴(kuò)增條帶。測(cè)定實(shí)驗(yàn)中獲得的單鏈抗體的濃度，參照文獻(xiàn)［4］計(jì)算抗體庫(kù)庫(kù)容量。隨機(jī)挑取的6個(gè)陽(yáng)性菌落PCR擴(kuò)增scFv基因片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行切膠回收，用BstNI酶切scFv基因片段，4%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切指紋圖譜，分析scFv基因片段多樣性。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見5 S、18 S和28 S 3條清晰條帶（圖1），總RNA質(zhì)量較好。

圖1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Electrophoresis of total RNA from human peripheral blood mononuclear cells

2.2 人VH、VL和Cκ基因的擴(kuò)增

經(jīng)過PCR擴(kuò)增，最終得到了長(zhǎng)度為335 bp的5個(gè)家族的VH基因片段、長(zhǎng)度為300 bp的10個(gè)家族的VL基因片段（5個(gè)Vκ家族基因和5個(gè)Vλ家族基因）以及作為單鏈抗體間隔區(qū)的長(zhǎng)度為320 bp的Cκ基因片段（圖2）。

2.3 VH和VL的易錯(cuò)PCR

將VH和VL基因經(jīng)過易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，得到了長(zhǎng)度為335 bp VH基因片段、長(zhǎng)度為300 bp的VL基因片段（圖3）。

2.4 DNA-shuffling

圖2 PCR擴(kuò)增VH、VL和Cκ基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 2 Electrophoresis of VH，VL and Cκgenes amplified by PCR

圖3 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增的人VH和VL基因凝膠電泳圖Fig 3 Electrophoresis of VH and VL genes amplified by error-prone PCR

D NaseⅠ消化改組模板，獲得大小在50～100 bp的DNA片段（圖4），隨后采用不加引物的PCR擴(kuò)增，經(jīng)過多次擴(kuò)增后當(dāng)序列的長(zhǎng)度接近目的基因的長(zhǎng)度時(shí)，進(jìn)行有引物擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為1 000 bp的scFv基因（圖5）。

2.5 單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建

隨機(jī)挑取6個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR，6個(gè)菌落都獲得了長(zhǎng)度約為1 000 bp的 scFv基因片段（圖6）。

圖6 菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 6 Electrophoresis of products with colony PCR

2.6 抗體庫(kù)庫(kù)容量及多樣性分析

本實(shí)驗(yàn)共獲得scFv基因產(chǎn)物48.9 μg，長(zhǎng)度為1 018 bp，經(jīng)計(jì)算，單鏈抗體庫(kù)的庫(kù)容量為4.37×1013。挑取的6個(gè)單菌落scFv基因經(jīng)BstNI酶切后得到的片段存在很大差異性（圖7），初步分析該單鏈抗體庫(kù)多樣性良好。

圖7 BstNI酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 7 Electropherogram of products with BstNI digested

3 討論

近年來(lái)，治療性抗體顯示出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景，但由于抗體種屬間的差異使其應(yīng)用受到了很大限制，抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)為這一問題的解決提供了一條新的途徑，為各種不同免疫原包括自身抗原的抗體獲得提供了一條有效的途徑［5］。然而抗體庫(kù)庫(kù)容不高一直是單鏈抗體技術(shù)需要解決的問題之一。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用易錯(cuò)PCR策略來(lái)創(chuàng)造突變體基因，易錯(cuò)PCR是目前應(yīng)用較多的隨機(jī)突變技術(shù)之一［6］，該技術(shù)是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、快速廉價(jià)的隨機(jī)突變方法。通過改變PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增的基因出現(xiàn)堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機(jī)突變。易錯(cuò)PCR突變基因?yàn)榻酉聛?lái)的DNA-shuffling提供了豐富的差異基因。DNA-shuffling是基因在分子水平上進(jìn)行重組。通過改變單個(gè)基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能?，F(xiàn)階段該技術(shù)以無(wú)以倫比的優(yōu)越性已發(fā)展成為比較普遍的研究核酸和蛋白質(zhì)體外定向分子進(jìn)化的一種強(qiáng)有力的技術(shù)［7］，已成功的用于工業(yè)用酶、抗體等多種重要蛋白質(zhì)的定向改造，使蛋白質(zhì)的酶活性、底物特異性及抗體親和性、蛋白功能、熱穩(wěn)定性等得到顯著提高［8］。本實(shí)驗(yàn)利用易錯(cuò)PCR獲得的突變基因，再結(jié)合抗體基因家族進(jìn)行改組，大大提高了體外進(jìn)化的效率以及基因的多樣性。為大容量人源抗體庫(kù)的構(gòu)建提供了良好的解決方案。成功獲得的單鏈抗體庫(kù)，為后續(xù)篩選得到高親和力抗體奠定了基礎(chǔ)。

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The introduction of error-prone PCR and DNA-shuffling technology to build mono-chain antibody library

YANG Hao1，YANG Qing-ping2，ZHA Cheng-xi1，HAN Yue-wu1*

（1.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University;2.Endocrine Branch，the Third People's Hospital of Gansu，Lanzhou 730000，China）

ObjectiveTo construct a mono-storage capacity single-chain antibody（scFv）library using error-prone PCR and DNA-shuffling technologies.MethodsPeripheral blood was collected from different age，gender and healthy people.Total RNA was extracted from human peripheral blood mononuclear cells and reversely transcribed to cDNA by RT-PCR.VH and VL genes were amplified by PCR and mutated by error-prone PCR.The full-length ScFv fragments were recombinated with the DNA-shuffling technologyin vitro，and then connected with T vector and transformed intoE.coliDH5α.Antibody library diversity was identified by restriction enzyme digestion after colony PCR，and then the capacity of scFv was calculated.ResultsThe 4.37×1013capacity and better diversity ScFv library was constructed by error-prone PCR and DNA-shuffling techniques.ConclusionsThe scFv library with high-storage capacity and genetic diversity has been constructed，which laid a foundation of selection high-affinity antibodies.

error-prone PCR;DNA-shuffling;scFv library

R 392.11

A

1001-6325（2012）01-0056-05

2011－01－07

2011－07－29