李亞琳
(渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,陜西渭南 714000)
新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)是單股負(fù)鏈RNA病毒,具有天然的在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的特點(diǎn)?,F(xiàn)在有一種觀點(diǎn)認(rèn)為,NDV也可以在活化的非正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中高效復(fù)制。早在1976年就有報(bào)道,NDV能夠在活化的T細(xì)胞中復(fù)制,并導(dǎo)致活化T細(xì)胞的死亡;后來又有報(bào)道證明,NDV能夠在非正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中高效復(fù)制[1]。
肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,其活化是肝纖維化發(fā)生的主要原因,而肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化,改善肝癌狀況的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[2]。由于活化HSC也是一種非正常的、具有增殖能力的轉(zhuǎn)化細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)以該細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn),探討溶瘤NDV在活化HSC中的復(fù)制情況,為肝纖維化治療以及肝癌的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。
人肝星狀細(xì)胞系LX-2(美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)院Scott L.Friedman教授饋贈(zèng));重組NDFLtag-EGFP和溶瘤株 NDV-Italien(德國(guó)癌癥研究中心 Volker Schirrmacher教授饋贈(zèng))。NDFLtag-EGFP是由NDV LaSota株經(jīng)過反向遺傳技術(shù)獲得,能夠表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)。
DMEM培養(yǎng)基(Hycolon公司);新生牛血清(中國(guó)杭州四季青公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);ReverTra Ace-α-TM(Toyobo公司);Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司);α-SMA、COLLAGENⅠ、TGF-β1 以及GAPDH引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成);重組人 TGF-β1(PeproTech Asia公司);雞抗NDV-HN一抗和兔抗雞IgY-FITC二抗(USBiological公司)。
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的制備:LX-2和小鼠原代培養(yǎng)HSC于37℃、5%CO2及飽和濕度下分別用DMEM(含5%或10%NBCS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.2 病毒的制備:將10 000 HU的NDV-Italien和NDFLtag-EGFP,按104~106倍稀釋,接種9~10日齡(溫度37℃,濕度60% ~65%的孵箱孵育9~10日)的無特異病原體(specific pathogens free,SPF)雞胚(梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,北京),每只雞胚注射100 μL病毒到尿囊腔。繼續(xù)在溫箱中孵育3~4 d,每天翻蛋2次。第4天,將所有的雞胚置于4℃冰箱過夜以便于雞胚中的血液凝固,利于病毒收獲。
從4℃凍存的雞胚中吸出尿囊液,經(jīng)低速離心,棄去沉渣,含NDV的上清液再經(jīng)超速蔗糖密度梯度離心純化病毒。沉淀物用PBS重懸,血凝法測(cè)定NDV的滴度,并調(diào)整為5 000 HU,分裝,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 NDV的感染:細(xì)胞按一定密度接種在培養(yǎng)板中,過夜,待細(xì)胞完全貼壁后,用不含血清的培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次,然后加入一定稀釋濃度的NDV,置培養(yǎng)箱中1 h。棄掉病毒液,再用不含血清的培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次,換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
1.3.4 MTT檢測(cè)TGF-β對(duì)LX-2細(xì)胞的促增殖效應(yīng):LX-2細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,換成含0.5%NBCS的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h。TGF-β1用含有2%NBCS的 DMEM 分別稀釋成 2、1.5、1、0.5 和0.25 μg/L。對(duì)照孔不含TGF-β1。饑餓24 h后,細(xì)胞換上以上不同稀釋濃度的TGF-β1,每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加5 g/L的 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]溶液10 μL,4 h后,棄掉培養(yǎng)上清,每孔加100 μL的 DMSO,溶解形成的甲臢結(jié)晶,于490 nm分光光度法檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞增殖率,公式為:細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度值-對(duì)照組細(xì)胞吸光度值)×100%/對(duì)照組細(xì)胞吸光度值。
1.3.5 半定量RT-PCR分析LX-2細(xì)胞的基因表達(dá):LX-2細(xì)胞接種于6孔板中,按上述方法用含0.5%NBCS的DMEM培養(yǎng)基饑餓后,再用2 μg/L TGF-β1 刺激。24 h后,每孔加1 mL Trizol,置冰上裂解細(xì)胞5~10 min,收集裂解液到1.5 mL Eppendorf管中。根據(jù)Protocol提取總RNA,并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm處的吸光度值,計(jì)算RNA的含量和純度。
采用兩步法 RT-PCR檢測(cè) α-SMA、COLLAGENⅠ和 TGF-β1的表達(dá)。首先每個(gè)樣品取2 μg RNA,Oligo(dT)為引物,反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL,用 ReverTra Ace-α-TM試劑盒反轉(zhuǎn)錄形成第1股cDNA。運(yùn)行條件是:42℃延伸30 min,99℃終止5 min。然后用rTaq polymerase和特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣品取2 μL的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR,反應(yīng)體系25 μL,運(yùn)行條件是:94℃ 預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,不同退火溫度下引物結(jié)合30 s,72℃ 延伸30 s,35 個(gè)循環(huán)后,再72℃ 延伸10 min。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參。
表1 RT-PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-PCR
1.3.6 熒光顯微鏡技術(shù)觀察NDFLtag-EGFP在LX-2及原代培養(yǎng)的小鼠HSC細(xì)胞中的復(fù)制:HSC細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中會(huì)自發(fā)活化,因此實(shí)驗(yàn)用NDFLtag-EGFP(1∶100稀釋)感染不同傳代的LX-2細(xì)胞和原代分離以及傳代的小鼠HSC細(xì)胞,觀察NDV在細(xì)胞中的復(fù)制情況。兩種細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到6孔板(預(yù)鋪蓋玻片)。24 h貼壁后或用2 μg/L TGF-β1預(yù)刺激后,按照上述方法進(jìn)行NDFLtag-EGFP感染,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后用熒光顯微鏡直接觀察NDV在細(xì)胞中的復(fù)制情況。1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)定量NDFLtag-EGFP和NDVItalien在 LX-2細(xì)胞中的復(fù)制:NDFLtag-EGFP(1∶100稀釋)感染不同傳代的LX-2細(xì)胞,然后用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,F(xiàn)ACS)檢測(cè)熒光強(qiáng)度以定量NDV在細(xì)胞中的復(fù)制。對(duì)于NDV-Italien的感染,需要將 LX-2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到6孔板。24 h貼壁后,用含有0.5%NBCS的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h。然后用2 μg/L TGF-β1預(yù)刺激LX-2細(xì)胞使其活化,再用NDV-Italien(1∶500稀釋)感染細(xì)胞,24 h后消化細(xì)胞,并用雞抗NDV-HN一抗和FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗檢測(cè)NDV-Italien在LX-2細(xì)胞中的表達(dá),并用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,F(xiàn)ACS)檢測(cè)NDV在細(xì)胞中的復(fù)制。
不同濃度的TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞24 h后,MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖。TGF-β1促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖,且具有劑量依賴性,當(dāng)其濃度為2 μg/L時(shí),細(xì)胞增殖率為24.6%(圖 1A)。用2 μg/L TGF-β1 刺激 LX-2 細(xì)胞,RT-PCR 檢測(cè)顯示,細(xì)胞中 TGF-β1、α-SMA和COLLAGENⅠmRNA的表達(dá)均顯著上調(diào) (P<0.05)(圖1 B)。RT-PCR電泳條帶的灰度掃描結(jié)果(表2),數(shù)字為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(±s)。
表2 RT-PCR電泳條帶的灰度掃描結(jié)果Table 2 The result of gray scanning for RT-PCR electrophoretic band
用NDFLtag-EGFP感染不同傳代的LX-2細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在傳代次數(shù)多的細(xì)胞中病毒復(fù)制率高,而在傳代次數(shù)少的細(xì)胞中病毒復(fù)制率低(圖2A)。FACS分析顯示,NDV復(fù)制率從P1代的15.65%±0.92%增加到P16代的23.05% ±1.5%(圖2B)。進(jìn)一步用FACS檢測(cè)了NDV-Italien在活化 LX-2細(xì)胞中的復(fù)制。LX-2細(xì)胞經(jīng)2 μg/L TGF-β1刺激活化后,NDV在細(xì)胞中的復(fù)制率增加了1.8倍,NDV復(fù)制率從12.8% ±1.4% 增加到22.7% ±1.7%(圖2C)。
圖1 TGF-β1促進(jìn)LX-2的活化Fig 1 TGF-β1 stimulated LX-2 cells to be activated
用NDV感染分離的原代培養(yǎng)的小鼠HSC。結(jié)果顯示,隨著原代分離細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和傳代次數(shù)的增加以及 TGF-β1的刺激,細(xì)胞趨于活化,NDFLtag-EGFP在細(xì)胞中復(fù)制的效率也逐漸增加(圖3)。
本實(shí)驗(yàn)用到了兩株NDV,NDV-Italien和 NDFLtag-EGFP。NDV-Italien為野生型強(qiáng)毒株;NDFLtag-EGFP來源于弱毒株NDV-LaSota,其F基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變,并將EGFP基因插入在NP基因的上游,因此能夠直接通過熒光顯微鏡觀察病毒在細(xì)胞中的復(fù)制情況[3]。
肝組織中HSC細(xì)胞的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵。肝癌和肝硬化患者的肝組織中,α-SMA陽(yáng)性的HSC大量浸潤(rùn)也充分說明活化HSC在肝癌和肝硬化發(fā)展中的重要作用[4-5]。因此,靶向HSC的抗纖維化治療是一個(gè)重要的阻止肝癌肝硬化發(fā)生的有效途徑[6-7]。
HSC的活化有許多誘發(fā)因素,但受損的肝細(xì)胞分泌許多細(xì)胞因子來刺激其活化卻是最主要的原因之一。這些細(xì)胞因子中,最主要的是 PDGF和TGF-β1。TGF-β1主要是在HSC由靜止?fàn)顟B(tài)到活化狀態(tài)的成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型過程中起作用,誘導(dǎo)HSC活化并產(chǎn)生過量的ECM進(jìn)而形成肝纖維化[8]。因此本實(shí)驗(yàn)用TGF-β1刺激LX-2使其活化。
實(shí)驗(yàn)用不同的方法調(diào)查了NDV在LX-2細(xì)胞中的復(fù)制情況。因?yàn)長(zhǎng)X-2細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中可以隨著傳代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而自發(fā)的活化[9-10],因此用NDFLtag-EGFP感染不同傳代的LX-2細(xì)胞,然后用熒光顯微鏡直接觀察或者用FACS分析NDV在細(xì)胞中的復(fù)制。結(jié)果證明,在傳代次數(shù)多的LX-2細(xì)胞中NDV的復(fù)制率越高,反之亦然。TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞使其活化后,NDV-Italien在活化的LX-2細(xì)胞中的復(fù)制效率也大幅度提高。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論,本實(shí)驗(yàn)用NDFLtag-EGFP感染原代分離的小鼠HSC,也得出了一致的結(jié)果,即隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)以及TGF-β1的刺激,細(xì)胞越趨于活化,NDV的復(fù)制效率也越高。所有這些結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè),活化的HSC細(xì)胞更有利于NDV的感染,說明HSC細(xì)胞的活化易化了NDV在其中的復(fù)制。
NDV在臨床治療中因極少產(chǎn)生負(fù)面不良效應(yīng)而成為腫瘤生物治療的一個(gè)安全平臺(tái)[11]。它能夠在腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇性復(fù)制的主要原因是能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激壓力從而引起P53非依賴的細(xì)胞凋亡[12]。曾經(jīng)有關(guān)于NDV能在活化的T細(xì)胞中復(fù)制并促進(jìn)活化的T細(xì)胞凋亡的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)雖然證明了活化的非正常轉(zhuǎn)化的LX-2細(xì)胞是NDV復(fù)制的一個(gè)靶標(biāo),但未能解釋HSC的活化之所以能夠易化NDV復(fù)制的機(jī)制,這是以后研究中有待解決的問題。
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