膠質瘤細胞維甲酸代謝調控機制及其對細胞增殖的影響*

張繼君，謝思明，林琛蒞，翁澤平，杜 展，王 超，鐘雪云

(暨南大學醫(yī)學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510632)

惡性膠質瘤是成年人中最為常見的原發(fā)性腦腫瘤，盡管手術、放化療技術不斷發(fā)展，但膠質瘤的預后仍然較差。膠質瘤的預后情況與其分化程度密切相關，高級別的膠質瘤包括膠質母細胞瘤和間變性星形細胞瘤都具有較低的分化水平和較高的死亡率，尤其是膠質母細胞瘤病人中位生存時間還不到1年［1］。通過各種手段努力提高膠質瘤的分化水平已成為膠質瘤治療的關鍵所在。

維甲酸是目前研究應用最為廣泛的誘導分化劑之一，全反式維甲酸(all－trans retinoic acid，ATRA)聯(lián)合三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)已經(jīng)成功應用于急性早幼粒細胞白血病的治療并且取得顯著的療效［2］，但是ATRA在實體腫瘤和其它類型白血病應用不多。維甲酸作用于人腦膠質瘤細胞能否誘導其分化，維甲酸在膠質瘤中合成過程又受到哪些因素的影響?這些都是值得我們深入探討的問題。

醛脫氫酶1家族成員A1(aldehyde dehydrogenase 1 family member A1，ALDH1A1)將維甲酸的前體氧化成維甲酸［3－5］，從而在維甲酸合成過程中發(fā)揮重要作用。KLF9(Krüppel－ like transcription factor 9)屬于17個KLFs家族成員之一，具有誘導神經(jīng)球細胞分化，抑制神經(jīng)球形成的能力［6］。前期研究已經(jīng)證明KLF9在SWO－Z2細胞中有表達，ALDH1A1基因在SWO－Z2中相對高表達。最近的研究表明子宮內膜癌中KLF9的表達高低與惡性程度負相關，并且KLF9可以調控ALDH1A1基因的表達［7］，在膠質瘤中是否有同樣的調控關系目前還沒有研究報道。本文通過小分子干擾實驗來證明KLF9和ALDH1A1存在一定的調控關系，同時用ATRA處理SWO－Z2細胞觀察其增殖分化能力變化，探討維甲酸在膠質瘤中可能的合成調節(jié)過程，旨在研究膠質瘤細胞維甲酸的可能合成調控機制，以及維甲酸對膠質瘤細胞的增殖分化作用及其可能的機制。

材料和方法

1 主要材料與儀器

人腦膠質瘤細胞SWO－38由暨南大學醫(yī)學院病理學教研室自建［8］，SWO－Z2細胞從 SWO－38細胞系中通過單克隆形式分離獲得［9］;ATRA、9－cis RA和13－cis RA均購于 Sigma;改良型 RPMI－1640購自HyClone;CCK－8購自WST;Real－time PCR試劑盒購于 TaKaRa;KLF9抗體購于Santa Cruz;ALDH1A1抗體購于 Abcam;cyclin D1、cleaved PARP、Bcl－2、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)和內參照β－actin均購自CST;細胞裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天公司;ECL化學發(fā)光試劑購自Pierce;小分子干擾序列(si－RNA KLF9)由銳博公司設計合成;Real－time PCR引物由英俊公司合成;LipofectamineTM2000脂質體購于Invitrogen;垂直電泳槽及半干式電轉移儀器均購自Bio－Rad。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) SWO－Z2細胞于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為改良型RPMI－1640培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)。取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的SWO－Z2細胞(不含抗生素的培養(yǎng)基)，以1.5 ×105cells/well接種于6孔板，24 h后細胞密度達到大約40%左右的匯合度。

2.2 siRNA－脂質體混合物的制備及轉染 制備過程嚴格遵守脂質LipofectamineTM2000脂質體說明書要求，優(yōu)化siRNA和脂質體的用量進一步提高轉染效率。最終選用的siRNA濃度為50 nmol/L，稀釋siRNA和LipofectamineTM2000轉染試劑所選用的培養(yǎng)基均不含血清和抗生素，轉染約6h后更換含有血清不含抗生素的培養(yǎng)基。

2.3 RT－PCR法檢測SWO－Z2細胞維甲酸受體(retinoic acid receptors，RARs)mRNA 水平，以及KLF9被干擾后KLF9和ALDH1A1 mRNA表達 分別提取SWO－Z2細胞和轉染24 h后SWO－Z2細胞的RNA，紫外分光光度儀測定RNA樣品純度和含量，逆轉錄試劑盒說明書提供的方法逆轉錄，逆轉后的cDNA作為PCR的模板進行PCR擴增。RARα上游引物5'－GACCGGCTCTTGAGACATCC－3'，下游引物5'－GGTGCTGGAGAGTGGTCAGA－3'，產(chǎn)物長度為372 bp。RARβ上游引物 5'－GGAACGCATTCGGAAGGCTT －3'，下游引物5'－GCAAGACGG ACTCGCAGTGT－3’，產(chǎn)物長度為383 bp。維甲類X受體 α(retinoid X receptor α，RXRα)上游引物 5'－TCCTTCTCCCACCGCTCCATC－3'，下游引物 5'－CAGCTCCGTCTTGTCCATCT G－3'，產(chǎn)物長度為169 bp。KLF9上游引物 5'－TGGCTGTGGGAAAGTCTATGG －3’，下游引物 5'－CTCGTCTGAGCGGGAGAACT－3’，產(chǎn)物長度為124 bp。ALDH1A1上游引物5’－CTCCTCTCACGGCTCTTCAC－3’，下游引物 5'－CCATGGTGTGCAAACTCAA C －3'，產(chǎn)物長度為289 bp。陽性對照GAPDH上游引物5'－ACAGTCAGCCGCATCTTCTT －3’，下游引物 5'－GACAAGCTTCCCGTTCTCAG －3’，產(chǎn)物長度為259 bp。內參照β－actin上游引物5'－GTGGGGCGCCCCAGGCACCA －3'，下游引物 5'－CTCCTTAATGTCACGCACGATTT－3’，產(chǎn)物長度為540 bp。PCR反應條件:95 ℃預變性3 min，95 ℃ 3 s，55.6 ℃ 6 s，72 ℃10 s，40 個循環(huán)，2－ΔΔCt法分析沉默效率。取 PCR 產(chǎn)物5 μL瓊脂糖凝膠電泳，Bio－Rad凝膠電泳成像儀攝像，運用Quantity One軟件對條帶進行累計吸光度值(IA)測定，并計算目的基因與內參照基因條帶灰度的相對比值［10］。

2.4 維甲酸對人腦膠質瘤細胞SWO－Z2的增殖抑制作用 應用CCK8試劑盒檢測細胞增殖抑制率［11－13］，SWO － Z2 細胞經(jīng) 2.5%胰酶消化后，改良型RPMI－1640完全培養(yǎng)基制備2×107cells/L細胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL。24 h后處理組分別加入梯度濃度的9－cis RA、13－cis RA和ATRA，0.1%DMSO為對照組，每組濃度均設6個重復孔。72 h后每孔加入10 μL CCK－8溶液，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻。37℃繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后用酶聯(lián)免疫檢測儀在檢測波長450 nm，參比波長630 nm處測得A值，取6個復孔的平均值，按公式計算增殖抑制率［增殖抑制率=(1－實驗孔A值/對照孔A值)×100%］，每組實驗重復3次以上。

2.5 Western blotting法檢測沉默48 h后 KLF9和ALDH1A1蛋白，以及ATRA作用SWO－Z2細胞72 h后 GFAP、cleaved PARP、Bcl－2和 cyclin D1的蛋白表達情況 按試劑盒上說明書要求提取全細胞蛋白:收集細胞，離心后棄培養(yǎng)基，PBS(pH=7.2～7.4)洗滌細胞，按照1×1012cells/L加入預冷的RIPA Buffer和PMSF混合液。BCA試劑盒測定蛋白濃度。每孔蛋白量30 μg于12%和5%聚丙酰胺凝膠上電泳，電泳條件:0.02A恒流30 min，0.04 A恒流100 min;轉膜條件:0.35 A濕轉60 min將蛋白轉至PVDF膜。5%BSA室溫封閉100 min后剪下包含目的蛋白的 PVDF膜，加入Ⅰ抗 Bcl－2(1∶1000)、cleaved PARP(1∶1000)、cyclin D1(1∶600)、GFAP(1∶500)和內參照 β －actin(1∶1000)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜每次10 min，共3次，HRP標記抗體Ⅱ抗(1∶5000)室溫孵育1 h后TBST洗滌每次10 min，共3次。加強型化學發(fā)光液(ECL)發(fā)光，X光膠片暗室曝光、顯影、洗片。BI2000灰度掃描分析條帶IA進行統(tǒng)計學分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，進行兩樣本t檢驗和One－way ANOVA，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 KLF9 RNAi沉默后 KLF9和ALH1A1 mRNA的表達

RNAi干擾24 h real－time PCR結果顯示，干擾后KLF9及ALDH1A1 mRNA水平與對照組相比明顯下降(P＜0.01)。有效的干擾濃度為50 nmol/L，干擾效率超過50%。2－ΔΔCt法計算干擾前后mRNA表達差異倍數(shù)，見圖1。

Figure 1.Expression levels of KLF9 and ALDH1A1 mRNA detected by real－time PCR after KLF9 silencing.GAPDH served as a positive control..n=3.*P＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control.圖1 50 nmol/L RNAi沉默 KLF924 h后 KLF9和 ALDH1A1 mRNA的表達

2 KLF9沉默后KLF9和ALDH1A1蛋白的表達

小分子RNA干擾KLF9基因，有效濃度為50 nmol/L，48 h后Western blotting結果顯示，KLF9蛋白(條帶位于約32 kD)表達水平顯著下降(P＜0.05)，ALDH1A1蛋白(條帶位于約55 kD)表達也顯著下降(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Down－regulation of KLF9 and ALDH1A1 protein expression in SWO－Z2 cells with KLF9 siRNA treatment..n=3.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control group.圖2 KLF9沉默48 h后KLF9和ALDH1A1蛋白的表達

3 不同的維甲酸對SWO－Z2細胞的增殖抑制作用

在加入3種不同維甲酸72 h后，細胞增殖能力在不同程度上受到抑制，而相同濃度和作用時間條件下，3種不同維甲酸對SWO－Z2細胞的增殖抑制作用不同，其中ATRA效果最佳，見圖3。

Figure 3.Chagnes of the three kinds of retinoic acid on proliferation of SWO－Z2 cells detected by CCK－8 assay..n=3.＊＊P ＜0.01 vs 9 － cis RA or 13 － cis RA.圖3 CCK－8法檢測3種不同的維甲酸對SWO－Z2細胞增殖活性的影響

4 不同濃度的ATRA作用SWO－Z2細胞72 h后cyclin D1、cleaved PARP、Bcl－2和 GFAP 的變化

不同濃度ATRA(DMSO濃度＜0.1%)分別處理SWO－Z2細胞72 h后 Western blotting結果表明，cleaved PARP蛋白表達上調(P＜0.01)，Bcl－2蛋白表達下降(P＜0.05)，cyclin D1蛋白表達也明顯下調(P＜0.05)，細胞增殖能力下降甚至發(fā)生了凋亡，但GFAP在藥物處理前后沒有明顯變化，說明ATRA并沒有促進膠質瘤的分化，見圖4。

Figure 4.Western blotting was used to analyze the expression of cleaved PARP，cyclin D1，Bcl－2 and GFAP in SWO－Z2 cells treated with different concentrations of ATRA for 72 h.1:control group;2:5 μmol/L ATRA;3:20 μmol/L ATRA;4:50 μmol/L ATRA..n=3.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control group.圖4 不同濃度ATRA處理SWO－Z2細胞72 h后cleaved PARP、Bcl－2、cyclin D1和 GFAP 蛋白的表達

5 SWO－Z2細胞及ATRA處理后維甲酸受體的表達

結果表明，3種不同維甲酸受體在SWO－Z2細胞中表達很低，條帶非常弱，而且在不同濃度ATRA處理下3種受體mRNA表達幾乎沒有變化，見圖5。

Figure 5.Real－time PCR detection for the expression of RARα，RARβ and RXRα in SWO－Z2 cells..n=3.圖5 3種維甲酸受體在SWO－Z2細胞的表達以及ATRA對3種受體表達的影響

討 論

近年來隨著維甲酸能夠成功治愈急性早幼粒細胞白血病，人們又不斷研究維甲酸在其它實體腫瘤中的應用。惡性膠質瘤由于侵襲性強、易復發(fā)，且復發(fā)后病理級別上升和腫瘤異質性等自身獨特的生物學特征，導致其治療非常棘手。而傳統(tǒng)手術切除、放化療以及顯微外科技術、免疫治療和基因治療等先進診療技術都未能顯著的提高膠質瘤病人的5年生存率。維甲酸信號在調控胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，同時維甲酸信號調控異常是膠質瘤發(fā)病過程中的重要事件［5］，所以研究膠質瘤中的維甲酸信號是進行膠質瘤誘導治療方案的重要基礎。

維甲酸在體內的合成主要包括兩次氧化過程［14］，其中ALDH1A1在維甲酸前體氧化成為維甲酸(第二次氧化)的步驟中發(fā)揮重要作用［3－4］。KLF9又稱為基本轉錄元件結合蛋白，參與細胞生長發(fā)育、增殖分化以及細胞周期的調控，在維甲酸和血清兩種分化信號存在下KLF9的表達上調發(fā)揮誘導神經(jīng)球分化抑制神經(jīng)球形成的能力［15］。我們前期基因芯片、實時定量PCR以及Western blotting結果(待發(fā)表)都表明ALDH1A1和KLF9基因在SWO－Z2細胞中高表達，所以維甲酸的合成代謝和KLF9基因的表達情況可能存在密切的關系。通過基因沉默證實KLF9是ALDH1A1的上游調控基因，并且正調控ALDH1A1基因的表達促進維甲酸的合成，膠質瘤細胞中存在維甲酸合成調控信號。但是不同濃度的ATRA對人腦膠質瘤細胞具有抑制增殖作用，并且抑制效率與ATRA濃度呈正相關，同時不同濃度ATRA對膠質瘤細胞的GFAP表達幾乎沒有變化，而抑制增殖作用相關蛋白發(fā)生相應變化，這些說明ATRA作用于人腦膠質瘤并沒有誘導膠質瘤分化而是抑制膠質瘤的增殖甚至發(fā)生凋亡。

與膠質瘤相似，ATRA作用于實體腫瘤如非小細胞肺癌細胞［16］和肝癌細胞［17］會引起增殖抑制，凋亡標志物誘導表達，這些都說明ATRA在實體腫瘤中主要抑制腫瘤細胞增殖甚至發(fā)生凋亡。至于維甲酸在膠質瘤中發(fā)揮抑制增殖作用而沒有誘導其分化的原因尚不清楚。維甲酸既然在膠質瘤中存在合成調節(jié)但是具有誘導分化的作用，主要的原因是維甲酸受體在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達比較低或者缺失導致其沒有作用靶點。維甲酸受體包括兩類，即 RARs和RXRs，其中前者是維甲酸發(fā)揮誘導分化作用的主要受體。我們進一步檢測了SWO－Z2細胞中的3種維甲酸受體，結果表明維甲酸受體在膠質瘤細胞中比較低。而且在本研究中，不同濃度的ATRA作用于SWO－Z2細胞后，維甲酸受體表達幾乎沒有發(fā)生變化，可能的原因就是在細胞體外傳代培養(yǎng)過程中，細胞對維甲酸的敏感性發(fā)生變異，因為有研究表明原代培養(yǎng)的膠質瘤細胞對維甲酸的敏感性高于膠質瘤細胞株［18］。

綜上所述，一方面在人腦膠質瘤細胞中KLF9通過正調控ALDH1A1的表達促進維甲酸的合成;另一方面維甲酸作用于人腦膠質瘤細胞未能誘導分化而是引起腫瘤細胞的增殖抑制甚至發(fā)生凋亡，主要原因可能就是膠質瘤中的維甲酸受體表達較少且敏感性改變。本實驗為利用維甲酸對膠質瘤細胞的增殖抑制作用發(fā)揮抗腫瘤作用提供有力證據(jù)，同時也為提高維甲酸受體對藥物的敏感性從而應用維甲酸誘導治療膠質瘤提供新的思路。

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