閆克芹 韓代書

TOLL樣受體在睪丸炎癥反應(yīng)與精子發(fā)生中的功能

閆克芹 韓代書＊

（中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞生物學系，北京100005）

睪丸局部炎癥反應(yīng)以及系統(tǒng)性炎癥疾病均可以損傷雄性生殖能力，近年來對于TOLL樣受體（Toll-like receptor，TLR）調(diào)節(jié)睪丸功能的研究有了較大進展，為認識炎癥反應(yīng)與雄性生殖障礙之間的關(guān)系提供了新的線索。TLR介導的炎癥信號通路在睪丸內(nèi)除了抵御病原體外，還可以調(diào)節(jié)多種睪丸細胞的功能，從而影響精子發(fā)生。炎癥對精子發(fā)生的影響主要由于循環(huán)系統(tǒng)和睪丸中炎癥因子增多，它們可以破壞生精細胞的正常發(fā)育，損害睪丸體細胞對精子發(fā)生的正常調(diào)節(jié)。相關(guān)機理的深入研究可能為雄性不育的預防與治療提供新的思路，本文將綜述TLR介導的系統(tǒng)性炎癥疾病及睪丸局部炎癥反應(yīng)干擾雄性生育的研究進展。

Toll樣受體；炎癥反應(yīng)；睪丸功能；精子發(fā)生

1.前言

睪丸局部感染與炎癥反應(yīng)可以損害生育能力，通常表現(xiàn)為抑制雄激素合成、精子數(shù)目減少、暫時性喪失生育能力以及感覺不適和疼痛［1］。感染和炎癥能誘導機體產(chǎn)生毒性很高的活性氧簇（ROS）和其他毒素，也能誘導產(chǎn)生多種炎癥細胞因子、生物活性脂和一些酶。這些物質(zhì)可以破壞細胞與血管的正常功能，激活免疫細胞，從而損傷機體。局部炎癥反應(yīng)可引起相鄰細胞的凋亡、血管損傷、組織纖維化。一些系統(tǒng)性炎癥疾病也能損害雄性生殖能力，包括一些并不引起生殖管道感染的疾病，其中的機制所知甚少。

TLR是一類模式識別受體，可以識別多種病原體相關(guān)的分子，如脂多糖（LPS）、脂蛋白、核酸等，是介導機體天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵受體。TLR除表達于系統(tǒng)性免疫細胞外，還廣泛表達于其它組織細胞（包括多種睪丸細胞）中，啟動系統(tǒng)及組織局部炎癥反應(yīng)，可以調(diào)節(jié)炎癥對雄性生殖能力的影響［2］。

2.LPS誘導的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)對睪丸功能的影響

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁成份，可誘導很強的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，十多年前就被用來研究系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)對睪丸功能的影響。LPS在很寬的劑量范圍內(nèi)都能夠抑制睪丸間質(zhì)液產(chǎn)生，降低睪丸和血液中的雄激素（睪酮）水平［3］。這是因為LPS抑制垂體分泌黃體素（LH），也抑制睪丸間質(zhì)中的Leydig細胞合成睪酮。炎癥反應(yīng)對下丘腦-垂體-Leydig細胞這一內(nèi)分泌調(diào)控軸的作用，已經(jīng)有很多相關(guān)研究［4］。炎癥反應(yīng)過程中可產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如 促 炎 因 子 白 介 素 （IL）-1β、腫 瘤 壞 死 因 子（TNF）-α，ROS，氮氧化物和前列腺素。它們作用于下丘腦，抑制LH釋放激素的分泌，從而抑制垂體產(chǎn)生LH。同時這些炎癥介質(zhì)也可直接作用于Leydig細胞，抑制睪酮合成酶的表達［5］。

精子發(fā)生是一個復雜的、高度有序的細胞分化過程。這一過程需要生精細胞和支持細胞（Sertoli）之間的相互作用，并且受到促濾泡激素（FSH）和睪酮的調(diào)節(jié)。雖然低劑量的LPS能夠顯著抑制睪酮合成，但對精子發(fā)生的影響卻很小。當注射亞致死劑量的LPS時，能在幾周內(nèi)對生精細胞造成很嚴重的損傷［3］。無論注射低劑量還是高劑量的LPS，睪丸間質(zhì)血管中的單核細胞和中性粒細胞會瞬間升高，但是并不浸潤到血管外的睪丸組織中［6］。在注射高劑量LPS后四周時間內(nèi)，對精子發(fā)生的影響非常特別。注射后24小時，減數(shù)分裂中的細線期／粗線期生精細胞（在大鼠Ⅺ-ⅩⅢ期的生精上皮中）的發(fā)育被顯著抑制。在接下來的六天內(nèi)，這些細胞以及相鄰管腔側(cè)的圓形精子細胞都會提前釋放，并且Ⅺ-ⅩⅢ期的精母細胞和精子細胞的凋亡增多。這提出了一個問題：為什么第Ⅺ-ⅩⅢ期的生精細胞會容易受到影響？

值得注意的是，注射LPS后，大鼠的體溫并未升高，反而下降，這說明精子發(fā)生的損傷并非由睪丸溫度升高所致，而在臨床上卻把感染后體溫升高解釋為男性生育力下降的原因之一。盡管LPS處理過程中睪丸內(nèi)的睪酮水平顯著降低，但有證據(jù)表明睪酮水平降低也不能解釋精子發(fā)生的損傷：①低劑量注射LPS和高劑量注射LPS對睪丸內(nèi)睪酮的抑制作用相似，但低劑量的LPS并不導致明顯的生精細胞損傷［7］；②即使注射了高劑量的LPS，睪丸內(nèi)睪酮的含量只會減少70%，而在非LPS處理的大鼠中，當睪酮含量低至20%時，精子發(fā)生也能正常的進行［8］；③LPS處理與睪酮缺陷影響精子發(fā)生的表型不同，因為雄激素缺陷特異損傷第Ⅶ-Ⅷ期完整精子的形成［9］。

在注射高劑量LPS 3天時間內(nèi)，睪丸中的血管出現(xiàn)損傷，并且迅速破壞生精上皮［7］，這些損傷與睪丸的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，睪丸氧化應(yīng)激反應(yīng)包括誘導產(chǎn)生大量的應(yīng)激蛋白、熱休克蛋白60（HSP60）、高移動組合染色體蛋白1和2（HMGB1和HMGB2）以及增強脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、降低抗氧化活性、干擾線粒體功能及誘導生精細胞凋亡。

這些結(jié)果表明，LPS誘導的炎癥通過多種機制影響精子發(fā)生，其中，抑制Leydig細胞的功能、誘導血管損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)都是生精細胞損傷的重要原因。除了這些間接原因，炎癥刺激也可以直接作用于生精上皮。這并不需要LPS直接和生精上皮相互作用，因為睪丸間質(zhì)內(nèi)的細胞（包括巨噬細胞與Leydig細胞）能被LPS刺激產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)［4］。而且，在系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)過程中，循環(huán)系統(tǒng)中升高的炎癥介質(zhì)也能進入到睪丸。高劑量的LPS也可能進入生精上皮直接發(fā)揮作用，注射后LPS在睪丸中的分布是一個值得研究的課題。

3.TLR在睪丸中的表達

LPS或者其它炎癥介質(zhì)影響精子發(fā)生的機理近年來取得了較大進展，主要是由于發(fā)現(xiàn)了TLR在睪丸中的表達與功能。炎癥是機體應(yīng)對創(chuàng)傷或者感染的反應(yīng)，是快速激活天然免疫的機制，同時啟動獲得性免疫反應(yīng)過程。宿主模式識別受體（PRR）特異的識別病原體相關(guān)分子模式（PAMP）可以激活炎癥和天然免疫反應(yīng)，在細菌、病毒、真菌、原生病原蟲上都發(fā)現(xiàn)了PAMP。研究比較多的PRR是TLR家族，它們識別細菌和病毒的核酸以及其它一些病原體特有的分子，例如細菌的脂多肽、肽聚糖和LPS［10］。TLR屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由包外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成。胞外區(qū)由富含亮氨酸的重要序列組成，可以識別PAMP和DAMP。胞內(nèi)區(qū)由200個以上的氨基酸殘基組成，該序列與白介素-1（IL-1）受體胞內(nèi)區(qū)的保守序列有高度同源性，被稱為TOLL／ILIR（TIR）結(jié)構(gòu)域，功能是募集信號傳導的接頭分子。

人類中已發(fā)現(xiàn)10個TLR，在小鼠中又發(fā)現(xiàn)TLR11、TLR12、TLR13，但未發(fā)現(xiàn)人類的 TLR10［10］。它們主要表達于免疫系統(tǒng)的單核細胞系（如巨噬細胞及樹突狀細胞），而且也表達于許多組織中的成纖維細胞、上皮細胞，包括雄性生殖系統(tǒng)中的此類細胞［11，12］。TLR激活后的信號傳導依賴于TIR結(jié)構(gòu)域與多種銜接蛋白相互作用激活下游一系列信號傳遞分子。多數(shù)TLR通過與銜接蛋白髓系分化因子88（MyD88）相互作用，啟動依賴 MyD88的信號通路，導致核因子（NF）-κB及多種有絲分裂激酶（MAPK）（包括P38、AP1、和JNK）的活化，從而誘導炎癥基因的表達［13］。而TLR3與TLR4也可通過與含有TIR結(jié)構(gòu)域能誘導干擾素β的接頭分子（TRIF）相互作用，啟動依賴TRIF的信號通路，導致干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的激活，誘導Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）的表達［14］。這些細胞因子在抵抗病原體及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著重要作用。

另外兩類PRR包括核苷酸結(jié)合及寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（NLR）家族和視黃酸誘導基因樣受體（RLR）［13］。NLR識別胞漿中細菌的 PAMP，一些NLR，例如 Nod1和 Nod2，通過激活 NF-κB 和MAPK起作用，另一些NLR通過誘導產(chǎn)生半胱氨酸蛋白激酶1來激活靶細胞中的促炎因子IL-1β和IL-18，并且啟動caspase介導的細胞凋亡通路。RLR識別胞漿中的病毒RNA，激活NF-κB及誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素。PRR家族還在繼續(xù)擴大，現(xiàn)在還包括識別真菌的C型凝集素受體（CLR）［13］。

除了在睪丸巨噬細胞和樹突狀細胞中表達外，TLR也在幾種睪丸非骨髓來源的細胞中表達。大鼠和小鼠的Sertloi細胞表達 TLR2、3、4和5，TLR4的共受體MD2和CD14也在大鼠睪丸中表達［15］。而且，大鼠Sertoli細胞中已發(fā)現(xiàn) TLR1、10、11的mRNA［16］，小鼠Sertoli細胞中也表達低水平的TLR6、7和13的 mRNA［17］。到目前為止，已經(jīng)證實大鼠或者小鼠的Sertoli細胞中的TLR1-6可被相應(yīng)的配體激活［15，18］。大鼠的生精細胞在一定發(fā)育階段表達TLR2、3、4的mRNA。管周肌樣細胞表達TLR3、11和低水平的TLR2、4、6。Leydig細胞表達 TLR2 、3、4及10［15］。盡管生精細胞對TLR配體的直接反應(yīng)尚未被證實，Leydig細胞和管周肌樣細胞都對LPS起反應(yīng)［19］。位于胞漿內(nèi)的TLR8和TLR9，還未在睪丸細胞中發(fā)現(xiàn)。至于另外的PRR家族，在Sertoli細胞、管周肌樣細胞和生精細胞中發(fā)現(xiàn)了Nod1的mRNA，而Nod2只在生精細胞中被發(fā)現(xiàn)［16］。

4.Sertoli細胞對TLR配體和炎癥介質(zhì)的反應(yīng)

Sertoli細胞表達TLR可能是炎癥能直接調(diào)節(jié)精子發(fā)生的機制。LPS在體外可以抑制Sertoli細胞合成乳酸的能力以及血漿酶原活化劑的活性，它們對Sertoli細胞支持生精細胞的發(fā)育起著重要作用，并且LPS還能促進Sertoli細胞產(chǎn)生ROS、降低Sertoli細胞抗氧化的能力［20］。此外LPS可刺激Sertoli細胞表達一系列炎癥基因產(chǎn)物，包括IL-1α、IL-6、可誘導的一氧化氮合成酶（iNOS），以及一些免疫調(diào)節(jié)因子，如激活素 A（Activin A）［21］。除了LPS的受體（TLR4）外，Sertoli細胞還表達其它TLR，可被其它病原體成份激活，例如，病毒RNA可以激活Sertoli細胞的TLR3，誘導表達炎癥因子［22］。這些炎癥介質(zhì)在誘導睪丸炎中起著重要作用。

除了TLR外，Sertoli細胞的功能還受一些炎癥因子的調(diào)控，主要是IL-1α、IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β和IFN-γ［23］。而且Sertoli細胞本身就可以分泌這些炎癥介質(zhì)，已證明，Sertoli細胞分泌的IL-1α能夠以自分泌的方式刺激IL-6的產(chǎn)生［24］。睪丸間質(zhì)中的巨噬細胞及Leydig細胞也是炎癥因子的重要來源，盡管被刺激后這些間質(zhì)細胞比其它來源的巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)水平低很多，但表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)［18，25］。雖然尚未觀察到生殖細胞對TLR配體刺激的反應(yīng)，但在生理狀態(tài)下生殖細胞也分泌幾種炎癥因子，包括iNOS和 TNF-α［26］。值得注意的是，由于生殖細胞難以在體外存活及培養(yǎng)，限制了對TLR在生精細胞中表達與功能的研究。

來自成熟大鼠的Sertoli細胞與性成熟大鼠的Sertoli細胞對炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出很大的不同。當用LPS刺激后，來自未成熟大鼠的Sertoli細胞產(chǎn)生的IL-1α大部分存在于細胞內(nèi)，并不分泌到胞外［21］。相反的是，用相似劑量的LPS刺激成熟大鼠來源的Sertoli細胞，可將具有生物活性的IL-1α分泌到培養(yǎng)基中［23］。這些結(jié)果表明細胞內(nèi)與分泌形式的IL-1α可能在Sertoli細胞不同成熟階段發(fā)揮不同的功能［27］。

5.炎癥信號調(diào)節(jié)生精上皮周期

Sertoli細胞和生精細胞產(chǎn)生的炎癥相關(guān)分子可以在生理狀態(tài)下調(diào)節(jié)生精上皮的正常結(jié)構(gòu)與功能。在整個生精上皮周期中，不同發(fā)育階段的生精細胞可以調(diào)節(jié)Sertoli細胞表達IL-1α、IL-6、激活素A等炎癥因子。在第Ⅷ期的生精上皮中，隨著精子釋放到曲細精管的管腔，炎癥因子的水平會急劇升高［28］。這是由于Sertoli細胞吞噬殘體引起的，同時生精細胞也會相應(yīng)的高表達 NF-κB、TNF-α、iNOS［26］。生精上皮中炎癥因子水平不僅僅與精子釋放有關(guān)，還可以調(diào)節(jié)精原細胞和初級精母細胞DNA合成、相鄰Sertoli細胞之間血睪屏障的開啟與關(guān)閉，從而允許早期精母細胞穿越屏障進入管腔［29］。IL-1α促進精原細胞和初級精母細胞的增殖，同時也刺激Sertoli細胞分泌IL-6和激活素 A［30］。IL-6和激活素A又會抑制減數(shù)分裂的進行［31］。激活素A對不同發(fā)育階段生精細胞的增殖會起促進或者抑制的相反作用［32］。精子釋放之后產(chǎn)生的這些炎癥因子對后來的精原細胞和精母細胞的增殖與分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。另外，IL-1α、IL-6、激活素 A、TNF-α能調(diào)節(jié)Sertoli細胞的很多功能，包括乳酸和轉(zhuǎn)鐵蛋白的產(chǎn)生［33］，TNF-α可以促進生精細胞的存活［34］。

炎癥反應(yīng)會抑制FSH和睪酮對Sertoli細胞的調(diào)節(jié)作用。Sertoli細胞幾乎一直接觸FSH和睪酮，所以這兩種激素不會引起生精上皮周期中Sertoli細胞的功能變化。LPS、IL-1α、TNF-α介導的炎癥信號調(diào)控Sertoli細胞中激活素A及抑制素B的表達［23］，F(xiàn)SH通過誘導合成cAMP與激活蛋白激酶A發(fā)揮作用，這兩個通路之間具有明顯的抑制關(guān)系：IL-1α、IL-1β和 TNF-α能抑制FSH 介導的Sertoli細胞中芳香酶的活化及干細胞因子（SCF）的表達，TNF-α還能抑制FSH誘導Sertoli細胞產(chǎn)生乳酸的能力［35］。

Sertoli細胞中的炎癥信號通路和FSH信號通路之間相互調(diào)節(jié)的機理，目前還不清楚。LPS和IL-1α通過 MyD88介導的信號通路，激活 NF-κB、AP1以及 MAPK-p38和JNK起作用，TNF-α通過另外的機制激活TRAFs。IL-1和TNF-α都會激活Sertoli細胞的p38和JNK［36］，但抑制其它類型細胞中MAPK通路和cAMP信號通路之間的相互作用［37］。炎癥信號也可調(diào)節(jié)睪酮的功能：例如，TNF-α促進大鼠Sertoli細胞表達睪酮受體。盡管作用機制尚不清楚，Sertoli細胞和生精細胞產(chǎn)生的炎癥因子能夠調(diào)節(jié)Sertoli細胞對睪酮的應(yīng)答。

另外，IL-1α、TNF-α和 NO 能開啟組成血睪屏障的Sertoli細胞間的緊密連接，也能促使Sertoli細胞與生精細胞之間的連接解體［38，39］，這需要抑制連接蛋白表達，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的位置和蛋白酶抑制劑的活性，破壞Sertoli細胞肌動蛋白骨架。因此，精子釋放后Sertoli細胞與生精細胞產(chǎn)生的炎癥因子對打開血睪屏障，使早期初級精母細胞進入生精上皮的管腔起著重要作用。

6.炎癥反應(yīng)在睪丸生理和病理中的意義

精子釋放后，生精上皮炎癥因子水平的波動可以調(diào)節(jié)精原細胞的增殖、精母細胞的減數(shù)分裂、Sertoli細胞的活性和對激素的應(yīng)答、開啟血睪屏障允許早期初級精母細胞進入管腔。這些事件的啟動器是Sertoli細胞吞噬殘體。由于單獨的吞噬行為不足以引起炎癥，因此推測殘體中的成份能夠通過PRR，如Sertoli細胞的TLR，來激活炎癥反應(yīng)。雖然TLR是識別外來病原體PAMP的受體，但它們也能被機體內(nèi)源性分子激活。例如，生精細胞中的熱休克蛋白（Hsp60，Hsp70）及 HMGB1是多種TLR的配體［40，41］，哺乳動物細胞的 mRNA 可以激活TLR3和TLR7，而細胞內(nèi)源性CpG DNA能激活TLR9［42，43］。由于單一 TLR敲除小鼠表現(xiàn)出正常的生育能力，因此生精上皮中炎癥因子的變化可能由多種TLR調(diào)節(jié)。由于大部分生精細胞在發(fā)育過程中發(fā)生凋亡，Sertoli細胞吞噬凋亡的生精細胞時可能會啟動炎癥基因的表達。因此，炎癥信號可能是生精上皮中不同細胞間交流的機制。

盡管有證據(jù)表明在其他系統(tǒng)中TLR信號對于維持正常的生理過程起著重要作用［44］，但是TLR在正常精子發(fā)生中的作用還缺乏直接證據(jù)，需要做更多的研究。另一方面，睪丸細胞表達TLR和其它模PRR對睪丸病理學一定具有重要的作用。Sertoli細胞與生精細胞表達的TLR可能用于防御來自下游生殖管道的病原體［45，46］。生精上皮中炎癥信號和精子發(fā)生的緊密關(guān)系為認識系統(tǒng)性感染與炎癥反應(yīng)對睪丸功能的損傷機制提供了線索。正如前面提到的，在LPS處理的大鼠模型中第Ⅺ-ⅩⅢ期生精上皮中的細胞對急性炎癥特別敏感，而這一時期的生精上皮表現(xiàn)出明顯的類似炎癥反應(yīng)。因此，推測炎癥對精子發(fā)生產(chǎn)生的不利影響至少部分原因是由于循環(huán)系統(tǒng)和睪丸中炎癥介質(zhì)水平升高所致，它們在精子發(fā)生過程中的重要階段破壞生精細胞的正常發(fā)育。

7.結(jié)束語

男性不育、睪丸感染、以及由于非病原性炎癥導致的慢性陰囊或者會陰疼痛給眾多的男性和其伴侶帶來巨大的不幸，并為社會的健康保障系統(tǒng)增加巨大的負擔。男性不育的比例約為5%，其中大多數(shù)明確病因的男性不育與炎癥或者自身免疫有關(guān)。由泌尿生殖系統(tǒng)細菌感染、性傳播疾病以及非生殖系統(tǒng)感染（例如腮腺炎、SARS和肺結(jié)核）引起的睪丸炎癥經(jīng)常會導致暫時或者永久性男性不育［47］。炎癥信號通路對Sertoli細胞支持精子發(fā)生的能力具有重要的調(diào)節(jié)作用，這解釋了為什么炎癥通常會影響男性生殖能力。這些過程的調(diào)節(jié)機理還有待進行深入研究，以增加對男性不育的認識，并最終為預防及治療提供線索。

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R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.021

2011-10-10

2011-12-01

國家自然科學基金資助（30971459）

閆克芹，女（1987年），漢族，碩士研究生。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）