崔芳芹 賈雪梅 汪 淵 黃大可 李 報(bào)

高脂血癥大鼠下頜下腺內(nèi)AQP1和AQP5表達(dá)及意義

崔芳芹1，4賈雪梅1＊汪 淵2黃大可3李 報(bào)3

1（安徽醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室，2分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，3形態(tài)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032；4蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，安徽 233030）

目的 觀察高脂血癥大鼠下頜下腺內(nèi)AQP1和AQP5表達(dá)的變化。方法 雄性S D大鼠20只，隨機(jī)分為2組，對(duì)照組（C組）給予全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)；高脂飲食組（H組）給予高脂飲食 （飼料成分為膽固醇2%、豬油10%、基礎(chǔ)飼料88%）連續(xù)喂養(yǎng)2個(gè)月，各組動(dòng)物均不限制飲水。2個(gè)月成模后，取血檢測(cè)血脂；取大鼠下頜下腺組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（SP法）和計(jì)算機(jī)圖像分析。結(jié)果 ①血脂檢測(cè)結(jié)果：C組TG與H組TG比較有顯著性差異（P＜0.05）；C組TC和H組TC比較有顯著性差異（P＜0.05）。②免疫組化結(jié)果：C組大鼠下頜下腺AQP1平均光密度值與H組AQP1平均光密度值比較有差異性（P＜0.05）；C組大鼠下頜下腺AQP5平均光密度值與 H組AQP5平均光密度值比較有差異性（P＜0.05）。結(jié)論

高脂血癥大鼠下頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)AQP1和AQP5的表達(dá)減少，為探討高脂血癥導(dǎo)致下頜下腺分泌功能降低的病理機(jī)制提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

高脂血癥；水通道蛋白-1；水通道蛋白-5；下頜下腺；大鼠

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）多發(fā)于中老年人，但隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的變化，青年人患本病者正在逐年增加［1］。該病對(duì)身體的損害是隱匿、逐漸、進(jìn)行性和全身性的，高脂血癥正成為吞噬人類健康的隱形殺手，其嚴(yán)重性不容忽視［2］。血脂異常對(duì)機(jī)體的影響主要表現(xiàn)在兩方面：一是致動(dòng)脈粥樣硬化作用［3，4］及其繼發(fā)損害，二是直接損害各組織器官［5，6］。目前研究較多的是高脂血癥導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化［3，4］和腎結(jié)構(gòu)及功能損傷［6］。高脂血癥一般沒(méi)有明顯的臨床癥狀，因此不易引起人們的重視，往往是在體檢或其他檢查時(shí)被發(fā)現(xiàn)。有些中醫(yī)學(xué)者報(bào)道部分高脂血癥患者伴口干、尿少、便秘及頭暈等癥狀［5］，但其發(fā)病機(jī)制不清楚。眾所周知，下頜下腺是三對(duì)大唾液腺之一，70%的唾液由下頜下腺分泌，其唾液分泌量下降可能是引起患者口干的主要原因之一。已有研究表明水通道蛋白-1（AQP1）和水通道蛋白-5（AQP5）與唾液腺的分泌功能關(guān)系密切，對(duì)調(diào)節(jié)水的轉(zhuǎn)運(yùn)率，維持唾液量的分泌起重要作用［7］。高脂血癥是否能導(dǎo)致下頜下腺的分泌功能降低，目前尚未有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用高脂飲食復(fù)制高脂血癥大鼠模型，對(duì)其下頜下腺進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察高脂血癥大鼠下頜下腺內(nèi)AQP1和AQP5表達(dá)及變化，以期為探討高脂血癥對(duì)下頜下腺分泌功能的影響提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1.試劑

AQP1和AQP5的抗體和SP免疫組化試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.高脂血癥動(dòng)物模型復(fù)制及標(biāo)本制備

雄性 S D大鼠20只，體重110-160g，（由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，普通級(jí)）。隨機(jī)分為2組，對(duì)照組（C組）在室溫及穩(wěn)定濕度條件下，全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)；高脂血癥組（H組）給予高脂飲食 （飼料成分為膽固醇2%、豬油10%、基礎(chǔ)飼料88%）。高脂血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，按照1997年中華心血管病雜志編輯委員會(huì)血脂異常防治對(duì)策專題組《血脂異常防治建議》［8］。檢測(cè)禁食12-14小時(shí)后的血脂水平，凡血清總膽固醇≥5.72mmol／L （220mg／dl）或血清甘油三酯）≥l.70mmol／L （150mg／dl）者，可作為高脂血癥動(dòng)物模型復(fù)制。造模后，連續(xù)喂養(yǎng)2個(gè)月，在此期間各組動(dòng)物均不限制飲食和飲水。2個(gè)月后，所有大鼠禁食12h，麻醉后剖開(kāi)腹腔，迅速?gòu)母骨混o脈抽血5ml送檢各組甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）水平。取出下頜下腺，用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度為4μm）。

3.免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)SP法染色。所用抗體及稀釋度如下：一抗為兔抗鼠AQP1和AQP5的抗體，稀釋度為1：100，37℃孵育40min后，置4℃ 過(guò)夜；二抗為羊抗兔IgG血清，37℃孵育15min；辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液（以上試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 ），37℃孵育30min。標(biāo)本用DAB顯色后，脫水、透明和封片。

4.顯微鏡下判斷

不著色為陰性 （-）；淺棕色為弱陽(yáng)性（＋）；中等棕黃色為中等陽(yáng)性 （＋＋）；深棕黃色為較強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）；棕褐為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋＋）。

5.計(jì)算機(jī)圖像分析

在10×40倍光鏡下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組下頜下腺免疫組化染色切片AQP1和AQP5的圖像，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，再用metamorph生物圖像軟件計(jì)算各組AQP1和AQP5免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值（MOD）。

6.數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，分析各組AQP1和AQP5免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值（MOD），結(jié)果均用（（ˉx±s）表示，組間差異采用q檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.血脂檢查

C組TG與H組TG比較，有顯著性差異（P＜0.05）；C組TC和H組TC比較，有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組大鼠組血清血脂水平比較（（ˉx±s）（mmol／L）Table 1 The level of serum lipid in two groups（（ˉx±s）（mmol／L）

2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果表明AQP1和AQP5在兩組中均有不同程度的表達(dá)，C組大鼠下頜下腺AQP1和AQP5免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒主要存在于顆粒曲管、紋狀管等導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)（＋＋＋＋）（圖1，圖3）；與C組比較，H 組 AQP1和AQP5表達(dá)減少，呈中等陽(yáng)性至弱陽(yáng)性反應(yīng)（＋＋-＋）（圖2、圖4）。AQP1蛋白表達(dá)水平在H組明顯低于C組，兩組大鼠下頜下腺AQP1平均光密度值比較，有顯著差異性（P＜0.05）（表2）；AQP5蛋白表達(dá)在H組明顯低于C組，兩組大鼠下頜下腺AQP5平均光密度值比較，有顯著差異性（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組大鼠AQP1、AQP5平均光密度值（MOD）的比較（ˉx±s）Table 2 MOD of AQP1and AQP5positive cells in the submandibular gland of two groups（ˉx±s）

討 論

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）是指各種原因所致血液中膽固醇、甘油三脂等脂質(zhì)含量異常增高的一種全身脂代謝異常性疾病。其發(fā)生多與外源性脂質(zhì)攝入過(guò)多或內(nèi)源性脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。大量研究資料表明，高脂血癥是腦卒中、冠心病和心肌梗死獨(dú)立而主要的危險(xiǎn)因素［9，10］。本實(shí)驗(yàn)中健康大鼠接受高脂飲食兩月后其血中TG和TC明顯增高，提示高脂血癥大鼠動(dòng)物模型造模成功。

AQP是近十年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一族細(xì)胞跨膜蛋白，分子量為30kD左右。它們的發(fā)現(xiàn)從分子水平上揭示了水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)的基本機(jī)制。AQP在上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞含量較多，介導(dǎo)著不同類型細(xì)胞膜的跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)，參與水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外水平衡，對(duì)維持人體內(nèi)水平衡有重要意義［11］。目前AQP1的蛋白結(jié)構(gòu)研究的較清楚 ，它的一級(jí)結(jié)構(gòu)為含6個(gè)螺旋的單肽鏈，連續(xù)跨膜6次，含3個(gè)胞外環(huán)（A、C、E）和2個(gè)胞內(nèi)環(huán)（B、D），B環(huán)和 E環(huán)具有疏水性，B環(huán)位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，E環(huán)位于細(xì)胞外側(cè)，其余3個(gè)環(huán)為親水性，它們均存在細(xì)胞膜脂質(zhì)層中，其氨基端 （NH2-）和羧基端 （COOH-）位于細(xì)胞內(nèi)，整個(gè)AQP分子前后兩部分在序列上相似，呈對(duì)稱的鏡像結(jié)構(gòu)，并且B環(huán)和E環(huán)均具有天冬酰氨酸 -哺氨酸 -丙氨酸基本單元（APA），APA為 AQP家族的共有特征結(jié)構(gòu)，對(duì)水的通透性具有決定性作用。AQP1在人體內(nèi)分布廣泛，主要選擇分布在與液體分泌或吸收有關(guān)的上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，AQP1在涎腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中也廣泛存在，參與唾液分泌調(diào)節(jié)。AQP5在唾液腺和淚腺中含量豐富，與唾液和淚液的產(chǎn)生有關(guān)［12］。肖林等［13］在研究干燥綜合征（Sjogren，s Syndrome，SS）小鼠模型時(shí)觀察到實(shí)驗(yàn)組6周后小鼠下頜下腺出現(xiàn)腺泡細(xì)胞變性、萎縮，導(dǎo)管腔狹窄，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等結(jié)構(gòu)變化，AQP1、AQP5表達(dá)顯著下降，唾液分泌量嚴(yán)重減少，伴有明顯的口腔干燥癥狀。楊軍等［14］將外源性AQP1基因轉(zhuǎn)染到SS模型小鼠的下頜下腺，發(fā)現(xiàn)AQP1基因表達(dá)被上調(diào)，同時(shí)伴有唾液分泌量增加，從而減輕了SS模型小鼠的口腔干燥癥狀。有學(xué)者向X線照射損傷的小鼠下頜下腺腺管內(nèi)注射表達(dá)AQP1的腺病毒后，受損傷的腺管AQP1表達(dá)增加，同時(shí)唾液分泌量增加2-3倍。在1999年 Ma等［15］研究發(fā)現(xiàn)敲除AQP5基因的小鼠，經(jīng)毛果蕓香堿刺激，其唾液分泌量減少60%以上，從而推測(cè)AQP5在唾液分泌中起重要作用。在研究AQP5的調(diào)節(jié)方面，Smith等［16］研究口干癥患者口服干擾素α對(duì)三對(duì)大涎腺的影響，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，用 RT-PCR測(cè)定其AQP5mRNA的表達(dá)水平，再用 Western Blot技術(shù)證實(shí)IFN-α放大了AQP5在人類腮腺腺泡細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，首次揭示了干擾素α能上調(diào)AQP基因的表達(dá)。上述研究結(jié)果表明AQP1和AQP5在下頜下腺唾液分泌功能起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明高脂血癥大鼠下頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)AQP1和AQP5的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，從而提示高脂血癥時(shí)下頜下腺內(nèi)AQP1和AQP5表達(dá)減少，可能是導(dǎo)致下頜下腺分泌功能下降的重要原因之一，也可能對(duì)中醫(yī)學(xué)者報(bào)道的部分高脂血癥患者伴有口干的癥狀加以解釋。目前，HLP大鼠下頜下腺AQP1和AQP5表達(dá)減少的原因尚不清楚，我們分析可能與以下因素有關(guān)：①內(nèi)源性NO是體內(nèi)一種重要的氣體信號(hào)分子。它通過(guò)舒張血管，調(diào)節(jié)血壓，改變局部血流和抑制血小板聚集等作用，參與各臟器微循環(huán)的調(diào)節(jié)［17］。江一峰等［18］研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥時(shí)，過(guò)高的膽固醇和LDL濃度降低了eNOS的mRNA轉(zhuǎn)錄速率及其穩(wěn)定性。當(dāng)血液中的脂質(zhì)濃度長(zhǎng)時(shí)間處于較高水平時(shí) ，eNOS的表達(dá)下調(diào)使NO生成減少，導(dǎo)致血管舒張功能受到影響 ，血液循環(huán)的阻力增加 ，下頜下腺血流量降低，引起組織缺血缺氧，導(dǎo)致AQP的合成減少。②高脂血癥時(shí)游離脂肪酸 （FFA）和甘油三酯 （TG）的升高是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要原因［19］，使葡萄糖的代謝障礙，致機(jī)體合成AQPs所需能量供應(yīng)不足；③高血脂可以激活多種炎癥細(xì)胞，產(chǎn)生TNFa等炎癥細(xì)胞因子異常［20］，已有研究表明導(dǎo)TNFa能下調(diào)AQPs的基因表達(dá)［21］。④由高脂血癥所致的脂代謝紊亂性疾病的發(fā)展，目前認(rèn)為與氧自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷關(guān)系密切。高血脂激活蛋白激酶C，F(xiàn)FA［22］釋放增多，誘導(dǎo)氧自由基生成，同時(shí)也導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量的自由基，可直接損傷DNA，導(dǎo)致 AQPs的基因表達(dá)調(diào)控失衡［23］。AQP的研究起步較晚，其結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運(yùn)確切機(jī)制尤其是AQP的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚，有待近一步深入研究。

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圖 版 說(shuō) 明

圖1 正常大鼠下頜下腺顆粒曲管（1A）和紋狀管（1B）上皮細(xì)胞的胞漿呈AQP1免疫反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，（SP×400）。

圖2 高脂血癥大鼠下頜下腺顆粒曲管（2A）和紋狀管（2B）上皮細(xì)胞的胞漿呈 AQP1免疫反應(yīng)弱陽(yáng)性，（SP×400）。

圖3 正常大鼠下頜下腺顆粒曲管（3A）和紋狀管（3B）上皮細(xì)胞的胞漿呈AQP5免疫反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，（SP×400）。

圖4 高脂血癥大鼠下頜下腺顆粒曲管（4A）和紋狀管（4B）上皮細(xì)胞的胞漿呈AQP5免疫反應(yīng)中等陽(yáng)性，（SP×400）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Strong positive immuoreactivity of AQP1in epithelial cells of control group，granular convoluted tubule（1A），striated ducts（1B）（SP×400）

Fig.2 Lower positive immuoreactivity in of AQP1in epithelial cells of H group，granular convoluted tubule（2A），striated ducts（2B）（SP×400）

Fig.3 Strong positive immuoreactivity of AQP5in epithelial cells of control group，granular convoluted tubule（3A），striated ducts（3B）（SP×400）

Fig.4 Middle positive immuoreactivity in of AQP5in epithelial cells of H group，granular convoluted tubule（4A），striated ducts（4B）（SP×400）

Study on expression of AQP1 and AQP5 in the Submandibular glands of hyperlipidemia rats

Cui Fangqin1，4，Jia Xuemei1＊，Wang Yuan2，Huang Dake3，Li Bao31（Department of Histology and Embryology；2Molecular Biology Lab；3Morphological Central Lab ，Anhui Medical University，Hefei 230032，Anhui；4Department of Pathophysiology，Bengbu Medical College，Anhui，233030，China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of AQP1and AQP5in the submandibular glands of hyperlipidemia rats.MethodsTwenty rats were randomly divided into two groups，10rats each.The control group（group C）was given the grain diet，the hyperlipidemia group（group H）was given high-fat diet（cholesterol 2%，lard 10%and based feed 88%），both drinking water freely.After 2months，all rats were killed for assaying blood serum lipids，then the submandibular glands were taken for observing the results using immunohistochemical staining and image analysis .Results ①The differences in TG and TC between group were significant（P＜0.05）；the difference between TC of C group and TC of H group was significant（P＜0.05）.② The differences in the MOD of AQpland AQP5 between group C and H were significant（P＜0.05）.ConclusionThe expression of AQP1and AQP5is down-regulated in the submandibular glands of hyperlipidemic rats，which provides morphological evidence for the reduced secretory function of the submandibular glands of hyperlipidemia rats.

Hyperlipidemia；Aquaporin-1；Aquaporin-5；Submandibular Gland；Rats

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.016

2011-08-10

2011-11-28

蚌埠醫(yī)學(xué)院院課題基金（BY1004）

崔芳芹，女（年），講師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）