趙云霞 龔曉萌 劉德純 承澤農 趙 瑾

BRCA1、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的異常表達及臨床意義探討

趙云霞 龔曉萌1劉德純1承澤農1趙 瑾

（蚌埠醫(yī)學院病理生理學教研室；1蚌埠醫(yī)學院病理學教研室 安徽233030）

目的 探討B(tài)RCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白異常表達在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義。方法應用免疫組織化學S-P法檢測150例乳腺癌、20例不典型增生和30例良性增生性病變組織中BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白的表達；結合臨床病理指標進行分析。結果 乳腺癌組織和不典型增生組織中BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白表達與良性增生性病變組織中表達均具有顯著性差異（P＜0.05）。BRCA1蛋白失表達率隨乳腺癌組織學分級的增高而增高，在年齡＜50歲和ER（雌激素受體）陰性時BRCA1蛋白失表達率增高。PTEN蛋白的失表達與淋巴結轉移、ER失表達有關（P＜0.05）。Rb蛋白在乳腺癌Ⅲ級中失表達率較高，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。C-myc蛋白的過表達與組織學分級、淋巴結轉移及病理類型有關（P＜0.05）。C-myb蛋白的過表達與乳腺癌組織學分級有關（P＜0.05）。結論 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白異常表達均在乳腺癌的發(fā)生過程中起作用；PTEN、C-myc、C-myb蛋白的異常表達參與了乳腺癌的浸潤和轉移。

乳腺癌；免疫組織化學；癌基因；抑癌基因

乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤，自上世紀90年代以來，全球乳腺癌的發(fā)病率提高了10倍［1］。在我國，乳腺癌已成為危害婦女健康的主要惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首，已近30／10萬，全國乳腺癌平均死亡率約為3／10萬，且發(fā)病率和死亡率仍有增高趨勢［2］，對本病的防治不容忽視。目前的研究表明，腫瘤從遺傳學的角度上來說是一種基因病。各種環(huán)境和遺傳的致癌因素引起細胞非致死性的DNA損傷，從而激活原癌基因和滅活抑癌基因，繼而引起其表達的異常，使靶細胞發(fā)生惡性轉化。迄今，乳腺癌相關基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確，本研究旨在探討 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的表達狀況，并與其它較為確定的預后指標相比較，結合臨床病理資料進行分析評價，為腫瘤的預后判斷和防治提供科學依據。

材料和方法

1.研究對象

標本來源于蚌埠醫(yī)學院病理學教研室（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科）2004年至2006年手術切除乳腺組織存檔蠟塊標本，其中乳腺癌組織標本150例，所有患者均接受手術治療，術前未接受過化療、內分泌或放射治療，經病理確診，且外檢已做過ER、PR 檢測。年齡30-80歲，平均年齡47.45歲（中位數49歲），＜50歲者81例，≥50歲者69例。浸潤性導管癌（非特殊性）121例；浸潤性小葉癌14例；導管原位癌13例；髓樣癌2例。將浸潤性導管癌121例按照 WHO提供的方法進行分級［1］，其中Ⅰ級16例；Ⅱ級84例；Ⅲ級21例。按長徑計算，腫塊最小者0.8cm，最大者15cm。按TNM 分類［1］，腫瘤大小分為3組，T1期腫瘤最大直徑≤2.0cm者57例；T2期腫瘤直徑為2.0-5.0cm 者82例；T3期腫瘤最大直徑＞5.0cm者11例。本組病例中含有腋淋巴結清掃的病例95例，其中有58例發(fā)生轉移；未轉移者37例。ER、PR檢測結果以外檢中免疫組織化學（SP法）報告結果為準。ER陽性61例，ER陰性89例；PR陽性54例，PR陰性96例。標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制片。隨機選擇30例乳腺良性增生性病變標本作為對照。

2.方法和試劑

采用免疫組織化學S-P法，分別行BRCA1，PTEN，Rb，C-myc 和 C-myb 標 記。 鼠 抗 人BRCA1單克隆抗體（克隆系：MS110，工作濃度1：40），鼠抗人PTEN單克隆抗體（克隆號：17A），鼠抗人Rb單克隆抗體（克隆系：1F8），鼠抗人C-myc單克隆抗體（克隆系：9E／11），鼠抗人C-myb單抗體抗體（克隆系：4E3）及相關試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。嚴格按照免疫組織化學SP實驗步驟進行，用已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

3.結果判斷

BRCA1、Rb蛋白陽性表達定位于細胞核，PTEN、C-myb蛋白陽性表達定位于細胞質，C-myc蛋白陽性表達主要定位于細胞核，以胞核或胞質出現明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色。判定標準：以染色強度和陽性細胞比例評定陽性表達。細胞胞質或胞核出現定位明確、染色明顯的棕黃／棕褐色顆粒為陽性細胞。所占比例＞10%為陽性病例。

4.統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白在乳腺癌、乳腺不典型增生及乳腺良性增生性病變組織中的表達

BRCA1蛋白在良性增生性病變（對照組）中均有表達，乳腺不典型增生中失表達率為15.0%，乳腺癌中失表達率為12.7%，兩組均有顯著性差異（P＜0.05）（表1，圖1）。PTEN蛋白在乳腺癌中失表達率為65.2%，乳腺不典型增生中失表達率為50.0%，高于對照組的13.3%（P＜0.05）（表1，圖2）。Rb蛋白在乳腺癌中陰性表達例數為71例（47.3%），乳腺不典型增生中陰性表達率為40.0%，明顯高于對照組（P＜0.05）（表1，圖3）。C-myc在乳腺癌中陽性表達率為56.7%，乳腺不典型增生中陽性表達率為45.0%，均高于良性增生性病變組的陽性表達率16.7%（P＜0.05）（表1，圖4）。C-myb蛋白在乳腺癌組陽性表達率為63.3%，乳腺不典型增生組陽性表達率為65.0%，顯著高于對照組（P＜0.05）（表1，圖5）。

表1 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白在乳腺癌、乳腺不典型增生及乳腺良性增生性病變組織中的表達（n）Table 1 Expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb proteins in breast cancer，breast atypical hyperplasia and breast benign proliferative lesion tissues

2.乳腺癌中BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白表達與臨床病理指標的關系

BRCA1蛋白失表達與所列出的各臨床病理指標間均無顯著性差異（P＞0.05）。但其失表達率隨組織學分級增高而增高，在組織學Ⅰ級中無陰性病例，Ⅱ級、Ⅲ級中失表達率分別為9.5%和19.0%。在ER陰性和年齡＞50的病例中，BRCA1蛋白失表達率較高，但無統(tǒng)計學意義。PTEN蛋白表達缺失與淋巴結轉移、ER表達相關（P＜0.05）。Rb蛋白表達與各臨床病理指標均不具有相關性（P＞0.05），只是在組織學分級中其表達缺失率隨分級增高而增高，組織學Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級中表達缺失率分別為37.5%（6／16）、48.8%（41／84）和71.4%（15／21）。C-myc蛋白表達與乳腺癌組織學分級、組織學類型、及淋巴結轉移均有明顯關系（P＜0.05）。C-myb蛋白表達與乳腺癌組織學分級有關系（P＜0.05）。（表2）。

表2 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白表達與乳腺癌臨床病理指標的關系（n）Table 2 Correlation between expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc，C-myb and Clinicopathological features in breast cancer（n）

與組織學分級Ⅰ、Ⅱ級比較①P＜0.05；與淋巴結轉移陽性組比較②P＜0.05；與原位癌組比較③P＜0.05；與ER表達陽性組比較④P＜0.05。

討 論

BRCA1作為一種DNA結合蛋白，在正常乳腺上皮細胞核內起重要的轉錄調控作用，參與細胞周期調控及DNA損傷修復，抑制細胞進入增殖周期，阻止分裂，促進終末分化，誘發(fā)細胞凋亡，為一種重要的細胞周期負調控因子［3］。以往認為BRCA1作為一種抑癌基因，只在遺傳性乳腺癌中起作用，散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因突變非常罕見，甚至不存在。但近期研究表明，BRCA1基因突變在散發(fā)性乳腺癌中也起作用。本組研究結果與國內賴春寧［4］、楊舉倫［5］研究相一致。研究結果提示，BRCA1蛋白在無家族史選擇的病例中有一定的失表達率，表明BRCA1突變在散發(fā)性乳腺癌中同樣起著重要作用。BRCA1相關的家族性乳腺癌與更高的組織學分級和增殖活性明顯相關［6］。BRCA1過度表達會抑制雌激素受體的活化，在與BRCA1有關的腫瘤中往往有P53突變和ER陰性表現，所以BRCA1可能在較大程度上依賴P53或ER而發(fā)揮腫瘤抑制活性［7］。本研究中，BRCA1蛋白的失表達率隨組織學分級的增高而具有增高趨勢；在ER陰性病例中BRCA1蛋白失表達率高于ER陽性病例；在年齡＜50歲組BRCA1蛋白失表達率高于年齡≥50歲組，提示BRCA1蛋白表達缺失與乳腺癌惡性程度、年輕發(fā)病及預后差有一定關系。BRCA1蛋白失表達率乳腺不典型增生組明顯高于對照組，以及其在原位癌組中的突然增高，提示BRCA1蛋白的改變在乳腺癌的發(fā)生中具有重要意義。關于散發(fā)性乳腺中BRCA1失表達與臨床病理參數的研究報道甚少，尚需要更多病例的研究證實。本研究顯示，BRCA1蛋白的失表達在散發(fā)性乳腺癌中同樣提示乳腺癌發(fā)病風險，并對乳腺癌預后判斷具有一定指導意義。

PTEN是迄今為止發(fā)現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN通過其磷酸酶活性調節(jié)細胞內多種信號轉導途徑，從而調控細胞周期，促進細胞凋亡，抑制細胞生長。當PTEN基因發(fā)生突變后，其異常產物不具有上述功能，而失去了對細胞生長的負調控作用。Sano等［8］首先運用卡-邁兩氏存活點檢測發(fā)現PTEN蛋白表達高低與膠質瘤病人的病理分級及預后有關。病人預后越差，惡性程度越高，PTEN蛋白表達水平越低。本研究結果顯示PTEN蛋白失表達乳腺不典型增生組明顯高于對照組，且其與有無淋巴結轉移、雌激素受體狀況有關，提示PTEN基因突變在乳腺癌的發(fā)生中具有重要意義，并使腫瘤更具有侵襲和轉移能力，更容易發(fā)生淋巴結轉移。腫瘤ER陽性表達是乳腺癌對激素治療敏感，預后較好的獨立預后指標。PTEN蛋白失表達時往往伴有ER表達缺失，提示PTEN基因改變是乳腺癌預后較差的指標。上述研究結果與國內外多數報道［9，10］相符合。因此，我們認為PTEN在乳腺癌發(fā)生、浸潤、轉移過程中均具有重要作用，它是乳腺癌預后差的重要指標之一。聯合檢測PTEN與其它預后指標，對預測乳腺癌預后更有指導意義。

Rb基因是最早被克隆的腫瘤抑制基因，也是細胞周期中校驗點的關鍵因子［11］。國內外關于Rb與乳腺癌關系的研究罕有報道。國外研究顯示，乳腺癌中Rb蛋白的表達下調或失表達率為17%-46%［12］。本實驗結果顯示，Rb蛋白失表達乳腺不典型增生組明顯高于對照組，Rb蛋白在乳腺癌中的失表達率為47.3%，提示Rb基因蛋白的表達缺失在乳腺癌發(fā)生中具有重要意義。Rb蛋白與臨床病理參數的比較發(fā)現，Rb蛋白的失表達與各臨床病理參數均無關。但在組織學Ⅲ級中Rb基因蛋白失表達有明顯增高，此結果提示，Rb基因的改變在高級別乳腺癌發(fā)展中具有重要作用，或在低級別乳腺癌向高級別乳腺癌過渡中發(fā)揮作用。Dublin等［12］的研究也顯示，Rb蛋白的失表達率在組織學Ⅲ級中乳腺癌中有增高趨勢。本實驗結果提示，Rb蛋白失表達在乳腺癌的發(fā)展中可能起重要作用，Rb蛋白的檢測結果可能反映乳腺癌的惡性程度。

C-myc基因是發(fā)現較早的原癌基因之一。其編碼蛋白具有轉錄因子活性，有促進細胞增殖、調節(jié)細胞周期、抑制細胞分化、參與細胞凋亡的作用。國外報道在女性乳腺癌中C-myc基因擴增率在15.7%-25.0%不等，過度表達的陽性率為22%-45%［13］。國內報道P62C-myc在乳腺癌中的陽性表達率高于國外，為50%-65%，本實驗結果與之相一致。P62C-myc在乳腺不典型增生病變中已有較高表達，提示C-myc在腫瘤發(fā)生的早期已被激活，它參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程。Rao［14］等認為C-myc在良性增生、非典型增生、乳腺癌中的基因擴增是逐漸遞增的。關于與臨床病理指標關系的報道［15，16］很少且差異較大，但均提示，C-myc基因擴增在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用。有研究認為，在乳腺癌中標記腫瘤內部異質性的是C-myc和cyclinD1的擴增，而不是c-erbB-2的擴增［17］。這從側面證明，C-myc基因擴增在乳腺癌的發(fā)展中起著重要作用。本研究顯示，P62C-myc的表達與乳腺癌分級、淋巴結轉移、病理類型相關。組織學分級高低、淋巴結有無轉移、腫瘤是否浸潤是腫瘤惡性程度及預后的判斷指標。由此我們認為C-myc過表達與乳腺癌預后不良密切相關，且P62C-myc表達不受ER及PR狀況的影響，提示P62C-myc蛋白表達可能是乳腺癌重要的獨立預后標記因子。

C-myb編碼的蛋白質為核內轉錄調節(jié)因子，參與細胞增殖與分化的調控。有關C-myb與膠質瘤關系的研究有少數報道，認為C-myb表達水平與膠質瘤的級別有關，C-myb基因突變在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［18］。關于C-myb與乳腺癌的研究未見有報道。本研究結果提示C-myb蛋白在乳腺癌中有較廣泛的表達，具有重要作用，在乳腺不典型增生中也有較高表達，提示C-myb在腫瘤發(fā)生的早期已被激活。乳腺癌中C-myb蛋白表達與臨床病理參數的關系分析可知，C-myb蛋白的陽性表達與組織學分級有關，且隨組織學分級的增高，C-myb蛋白的陽性率增高。此結果提示，C-myb與乳腺癌細胞的分化有關。C-myb蛋白的高表達是乳腺癌惡性程度高的標志。

總之，本研究顯示BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白異常表達均在乳腺癌的發(fā)生過程中起作用；PTEN、C-myc、C-myb蛋白的異常表達參與了乳腺癌的浸潤和轉移。聯合檢測上述指標對乳腺癌的早期發(fā)現和預后判斷具有指導意義。

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圖 版 說 明

圖1 乳腺癌中BRCA1陽性表達定位于胞核（SP法×100）

圖2 乳腺癌中PTEN陽性表達定位于胞質（SP法×100）

圖3 乳腺癌中Rb陽性表達定位于胞核（SP法×100）

圖4 乳腺癌中C-myc陽性表達定位于胞核（SP法×100）

圖5 乳腺癌中C-myb陽性表達定位于胞質（SP法×100）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of BRCA1in cell nucleus of mammary carcinoma （SP method×100）

Fig.2 Expression of PTEN in cell plasmas of mammary carcinoma （SP method×100）

Fig.3 Expression of Rb in cell nucleus of mammary carcinoma （SP method×100）

Fig.4 Expression of C-myc protein in cell nucleus1of mammary carcinoma（SP method×100）

Fig.5 Expression of C-myb in cell plasmas of mammary car - cinoma （SP method×100）

Aberrant expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb and its clinical significance in breast cancer

Zhao Yunxia，Gong Xiaoming1，Liu Dechun1，Cheng Zenong1，Zhao Jin
（Department of Physiopathology；1Department of pathology，Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

ObjectiveTo investigate the roles of aberrant expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb in the development of breast cancer and its clinical significance.MethodsImmunohistochimistry（S-P method）was used to detect proteins of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb in 150cases of breast cancer，20cases of atypical hyperplasia and 30cases of benign proliferative lesions.The data was analyzed together with their relation to clinical pathological parameters.ResultsThe expressions of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb proteins had statistical difference between breast cancer and benign proliferative lesions，as well as between atypical hyperplasia and benign proliferative lesions（P＜0.05）.The negative rate of BRCA1protein increased with histological grade，younger age（＜50）and negative expression of ER.The loss of expression of PTEN protein was related with lymph node metastasis and the loss of ER expression（P＜0.05）.The loss of expression Rb protein was higher in breast cancer gradeⅢ，but with no statistical difference （P＜0.05）.Overexpression of C-myc protein was correlated with histological grade，lymph node metastasis and pathological type（P＜0.05）.Overexpression of C-myb protein was correlated with histological grade （P＜0.05）.ConclusionAberrant expressions of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb proteins play biological role in breast cancer development.Aberrant expressions of PTEN，C-myc and C-myb proteins are correlated with invasion and metastasis of breast cancer.

Breast cancer；Immunohistochimistry；Oncogenes；Anti-oncogenes

R737.9

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.013

2011-08-05

2011-10-28

安徽省教育廳高校青年教師基金（2007jq91133）

趙云霞，女（1977年），漢族，講師。