柴大敏 鮑正齊 馮振中 馬 莉 王丹娜 陶儀聲

食管鱗狀細(xì)胞癌中血管生成擬態(tài)及MMP-1蛋白的表達(dá)

柴大敏1＊鮑正齊2馮振中1馬 莉1王丹娜1陶儀聲1＊

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，蚌埠233030）

目的 研究人食管鱗狀細(xì)胞癌（human esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中是否存在血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）及其與（Matrix metalloproteinase-1，MMP-1）表達(dá)的關(guān)系，以及 MMP-1過(guò)表達(dá)的臨床意義。方法 收集118例食管鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)本，每例均有完整的臨床資料，利用CD31（Platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM-1）和PAS套染觀察是否存在VM，對(duì)VM組和對(duì)照組進(jìn)行 MMP-1染色，分析VM與MMP-1表達(dá)的關(guān)系及 MMP-1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 118例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中有34例（28.81%）存在VM，有VM生成組的 MMP-1過(guò)表達(dá)比例顯著高于無(wú)VM組，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MMP-1過(guò)表達(dá)的比例顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）；浸潤(rùn)至深肌層及外膜層的 MMP-1過(guò)表達(dá)的比例顯著高于浸潤(rùn)之粘膜層和淺肌層的（P＜0.05）；臨床分期Ⅲ-Ⅳ期的MMP-1蛋白的過(guò)表達(dá)顯著高于臨床分期Ⅰ-Ⅱ期的（P＜0.05）。結(jié)論 食管鱗狀細(xì)胞癌中存在VM，MMP-1的過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)VM形成；VM的存在和MMP-1過(guò)表達(dá)共同促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤(rùn)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；血管生成擬態(tài)；基質(zhì)金屬蛋白酶-1；免疫組化染色；轉(zhuǎn)移

食管癌是由食管粘膜上皮或腺體發(fā)生的惡性腫瘤，在十大惡性腫瘤中居第四位。全世界每年有30萬(wàn)人死于食管癌，其中約一半發(fā)生于中國(guó)。組織學(xué)上包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌等，其中以鱗狀細(xì)胞癌最為多見(jiàn)，約占食管癌的90%。食管鱗狀細(xì)胞癌早期癥狀不明顯，且容易局部浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。很多研究顯示MMP-1與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及血液供應(yīng)有密切的關(guān)系［1-2］。目前許多關(guān)于腫瘤血供途徑的研究主要集中在腫瘤血管生成（angiogenesis），即新生血管從瘤體附近組織向?qū)嶓w瘤定向出芽的過(guò)程。最近研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管生成并不是腫瘤獲得血供的唯一微循環(huán)機(jī)制。在黑色素瘤、炎性乳腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、胃惡性間質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌［3-7］等高度侵襲性腫瘤中，發(fā)現(xiàn)一種不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤內(nèi)血液供應(yīng)模式--血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）：腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形和基質(zhì)重塑產(chǎn)生血管樣通道而滿足自身血液供應(yīng)的方式。

本實(shí)驗(yàn)即通過(guò)CD34及PAS套染的方式觀察食管鱗狀細(xì)胞癌中是否存在VM，進(jìn)一步研究VM與MMP-1之間的關(guān)系及其臨床意義。

材料和方法

1.臨床資料

隨機(jī)挑選2007-2008年蚌埠醫(yī)學(xué)院病理教研室食管鱗狀細(xì)胞癌存檔標(biāo)本（石蠟包埋）118例，其中男85例，女33例；年齡為38-79歲（60.6±8.6）；組織學(xué)分級(jí)：高分化30例，中分化70例，低分化18例；浸潤(rùn)至粘膜層及淺肌層28例，深肌層及外膜層90例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，無(wú)轉(zhuǎn)移者66例；臨床分期Ⅰ-Ⅱ期32例，Ⅲ-Ⅳ期86例。所有患者術(shù)前均做過(guò)活檢且無(wú)家族史，術(shù)后經(jīng)3名以上病理學(xué)專家證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，且術(shù)前均未接受放化療。

2.主要試劑

鼠抗人單克隆抗體CD34（MAB-0034），克隆系JC／TOA（即用型，6ml）和DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新公司；PAS染色試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗人單克隆抗體 MMP-1購(gòu)自Neo-Markers公司（1：100稀釋）。

3.CD31和PAS套染及VM結(jié)構(gòu)觀察

按照Elivision兩步法操作，①免疫組化CD34步驟到DAB顯色后，血管內(nèi)皮著色后，水流沖洗1 min。②置于0.5%高碘酸中還原10min，水流沖洗。③置于Schiff液中10min，自來(lái)水沖洗。④蒸餾水返色10min。⑤蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，封片。

CD34和PAS套染的切片在顯微鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞圍繞成管腔樣結(jié)構(gòu)，管壁沒(méi)有CD34陽(yáng)性、呈梭形的內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞，這樣的管腔樣結(jié)構(gòu)判斷為VM。管壁有CD34陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞和PAS陽(yáng)性的基底膜樣結(jié)構(gòu)，無(wú)論管腔內(nèi)有無(wú)紅細(xì)胞，均判定為內(nèi)皮依賴性血管。

4.MMP-1免疫組化染色及結(jié)果判定

MMP-1（1：100），陽(yáng)性對(duì)照為結(jié)腸癌，陰性對(duì)照為PBS代替一抗。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性表達(dá)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。采用雙評(píng)分半定量法評(píng)分：①每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞；②陽(yáng)性細(xì)胞﹤10%為0分，10-50為1分，51-75為2分，﹥75為3分；③細(xì)胞不著色為0分，淺黃為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；④兩者分?jǐn)?shù)相乘0分為（-），2-3分為（＋），4-6分為（＋＋），＞6分為（＋＋＋）；≤3分為低表達(dá)，≥4分為過(guò)表達(dá)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.食管鱗狀細(xì)胞癌中存在VM現(xiàn)象

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)118例食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中有34存在VM。HE染色鏡下這些管道樣結(jié)構(gòu)由腫瘤細(xì)胞圍成，管道內(nèi)有紅細(xì)胞存在，紅細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞圍繞。CD34和PAS套染可見(jiàn)一層PAS陽(yáng)性的物質(zhì)圍城基底膜樣結(jié)構(gòu)分開(kāi)腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞，這些圍城管腔的腫瘤細(xì)胞CD34染色均為陰性，證實(shí)不是內(nèi)皮細(xì)胞（圖A），而CD34染色陽(yáng)性的為內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管（圖B）。

2.MMP-1的表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

整個(gè)上世紀(jì)80年代，全國(guó)東部沿海地區(qū)，特別是廣東深圳地區(qū)都在開(kāi)發(fā)開(kāi)放的前沿。上海作為老工業(yè)基地，是國(guó)有經(jīng)濟(jì)比較重的一個(gè)地方，同時(shí)也是國(guó)家的財(cái)政口袋，整個(gè)中央財(cái)政的1/4是由上海財(cái)政上交的資金貢獻(xiàn)的，上海相當(dāng)于是改革開(kāi)放的一個(gè)后衛(wèi)，也因?yàn)榇耍麄€(gè)80年代，上海經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展總體比較慢。鄧小平老人家在1990年這個(gè)關(guān)鍵的時(shí)候，推動(dòng)了上海的浦東開(kāi)發(fā)。老人家說(shuō)過(guò)，深圳的開(kāi)放是面對(duì)著香港的，珠海的開(kāi)放是面對(duì)著澳門(mén)的，廈門(mén)的開(kāi)放是面對(duì)著臺(tái)灣的，而上海浦東的開(kāi)發(fā)開(kāi)放是面對(duì)世界的。在老人家的心目中，浦東的開(kāi)發(fā)開(kāi)放，是一盤(pán)大棋中重要的一步棋。他甚至講過(guò)，浦東的開(kāi)發(fā)開(kāi)放晚了5年，如果要早一點(diǎn)起步更好。

食管鱗狀細(xì)胞癌組織 MMP-1陽(yáng)性表達(dá)率較高，本實(shí)驗(yàn)對(duì)象118例患者中有89例過(guò)表達(dá)（75.42%）（圖C，D）。其中浸潤(rùn)至深肌層和外膜層90例有79例過(guò)表達(dá)（80%），而浸潤(rùn)至粘膜層及淺肌層28例中17例過(guò)表達(dá)（60.7%）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組52例中44例過(guò)表達(dá)（84.6%），無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組66例中45例過(guò)表達(dá)（68%）；臨床分期Ⅲ-Ⅳ期組86例中70例過(guò)表達(dá)（81.4%），Ⅰ-Ⅱ期32例中19例過(guò)表達(dá)（59.4%）。MMP-1的過(guò)表達(dá)與患者年齡、性別、分化程度無(wú)關(guān)，但與腫瘤的浸潤(rùn)深度（深肌層和外膜層VS）、臨床分期以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（表1，P＜0.05）。

表1 MMP-1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 Over-expression of MMP-1protein in ESCC and the relationship with clinicopathological parameters.

3.MMP-1表達(dá)與VM的關(guān)系

118例食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中有34例存在VM，有 VM 組 MMP-1過(guò)表達(dá)的為30（88.24%）比率高于無(wú)VM（70.23%）組，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌中MMP-1蛋白的表達(dá)與VM的關(guān)系Table 2The expression of MMP-1protein in ESCC and the relation with vasculogenic mimicry（VM）

討 論

血管形成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程的必要條件。雖然到目前為止腫瘤血管生成的誘發(fā)和調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚，但對(duì)血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中所具有的重要作用已成共識(shí)。有報(bào)道，實(shí)體性腫瘤直徑大于2mm時(shí)，其進(jìn)一步的發(fā)展必須依賴于血管生成，這些新生的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)為腫瘤的生長(zhǎng)提供充分的氧養(yǎng)料，保證了腫瘤細(xì)胞的快速增殖能力。腫瘤組織內(nèi)的新生血管，一方面可通過(guò)保證腫瘤細(xì)胞的氧供、營(yíng)養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的排泄來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；另一方面，由于其管壁結(jié)構(gòu)缺乏完整性，內(nèi)皮細(xì)胞之間連接松散，基底膜厚薄不一、斷裂或缺如等原因，瘤細(xì)胞易于進(jìn)入血管腔而發(fā)生血行侵襲和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)（VM）作為一種新的高度惡性腫瘤血供方式正在被越來(lái)越多的人所接受。

VM是1999年被 Maniotis［8］等首次提出，即后來(lái)被Folberg等［9］描述的PAS（Periodic Acid-Shiff＇s Reaction，PAS）陽(yáng)性圖案：直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹樣的（沒(méi)有完全封閉）、有分支的彩虹樣的、封閉的環(huán)狀的和網(wǎng)絡(luò)狀的通道（即最少有3個(gè)背靠背的PAS陽(yáng)性環(huán)）。該通道的特點(diǎn)是無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記物（CD31，CD34，F(xiàn)Ⅷ）染色均為陰性，腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管形成而形成瘤細(xì)胞條索并圍成通道，而血液則在這無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞的通道中流動(dòng)，通道外周是一層厚薄不一的PAS陽(yáng)性物質(zhì)構(gòu)成的基底膜。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細(xì)胞癌中存在VM，且在VM周邊的腫瘤細(xì)胞很少有壞死發(fā)生。說(shuō)明在VM存在的情況下確實(shí)形成了有效的血液供應(yīng)模式。正如Zhang et al［10］.提出的腫瘤血供的“三階段現(xiàn)象”，即早期腫瘤的血供主要是VM形成的功能性微循環(huán)，之后內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入腫瘤細(xì)胞之間形成馬賽克血管，管腔由腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成，然后進(jìn)一步成熟為內(nèi)皮依賴性血管。

很多研究顯示，如果某些腫瘤組織存在VM現(xiàn)象其預(yù)后較差。但是，對(duì)于該通道形成的分子構(gòu)建及調(diào)節(jié)機(jī)制知之甚少。通過(guò)對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的三維成像研究發(fā)現(xiàn)VM的形成和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin），肝細(xì) 胞 肝癌-A2產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素（erythropoietin-producing hepatocellular carcicnoma-A2，EPHA2），基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和層粘連蛋白 （laminin 5-γ-2-chain，LAMC2）有關(guān)［11-13］?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）是降解細(xì)胞外基質(zhì)重要的酶類(lèi)，MMPs與是一類(lèi)依賴金屬離子鋅（Zn2＋）的鋅肽酶超家族，其作用底物為細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），MMPs幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的所有成分。間質(zhì)膠原酶（MMP-1），是第一個(gè)被定性的基質(zhì)金屬蛋白酶。MMP-1具有降解明膠、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型膠原和Ⅹ型膠原的作用，從而破壞基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。MMP-1和 MMP-2激活后能促進(jìn)LN-5γ2鏈裂解為γ2和γ2x，沉積于腫瘤細(xì)胞的外環(huán)境中，促進(jìn)腫瘤形成VM。Hedrix［14］等研究的惡性黑色素瘤細(xì)胞中LN-5γ2鏈及 MMPs在VM網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在區(qū)域高表達(dá)，應(yīng)用LN-5γ2寡義核苷酸和 MT1-MMP抗體可減弱或抑制VM的形成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌中存在VM組的MMP-1蛋白的過(guò)表達(dá)率顯著高于不存在 VM（P＜0.05）。MMP-1的過(guò)表達(dá)和患者的年齡，性別及腫瘤的分級(jí)無(wú)關(guān)（P＞0.05），而和腫瘤的浸潤(rùn)深度、臨床分期以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。

迄今為止，MMP-1蛋白促進(jìn)VM形成的具體機(jī)制上部清楚，這將是我們今后研究的重點(diǎn)。希望我的研究可以為臨床關(guān)于阻斷腫瘤的血供的"截流"療法提供指導(dǎo)意義。

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圖 版 說(shuō) 明

圖B 食管鱗狀細(xì)胞癌中內(nèi)皮依賴性血管（CD31和PAS套染 ×400）

圖C 食管鱗狀細(xì)胞癌中VM組MMP-1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（Elivision×100）

圖D 食管鱗狀細(xì)胞癌中VM組MMP-1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（Elivision×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.A There is VM in ESCC.（CD31and PAS double staining×400）

Fig.B Endothelium dependent blood vessel in ESCC.（CD31

and PAS double staining×400）

Fig.C Over-expression of MMP-1in ESCC.（Elivision×100）

Fig.D Over-expression of MMP-1in ESCC.（Elivision×400）

Vasculogenic mimicry in esophageal squamous cell carcinoma and the expression of matrix metalloproteinase-1

Chai Damin1＊，Bao Zhengqi2，F(xiàn)eng Zhenzhong1，Ma li1，Wang Danna1，Tao Yisheng1＊
（1Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College；Department of Pathology，Bengbu Medical College；2The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

Objective To study whether vasculogenic mimicry（VM）exist in human esophageal squamous cell carcinoma（ESCC），its relationship with matrix metalloproteinase-1（MMP-1）and clinicopathological parameters.Methods 118specimens of primary ESCC and their clinical data were collected，and dual staining of CD34and Periodic Acid-Schiff（PAS）were performed to validate the existence of VM in ESCC.MMP-1over-expression was then detected in both groups with and without VM to analyze the relationship between VM and MMP-1protein，and the correlation of MMP-1and clinicopathological parameters of ESCC.Results VM existed in 34（28.81%）of 118cases，and the over-expression of MMP-1in cases with VM was obviously higher than that without VM （P＜0.05）.The over-expression of MMP-1protein in patients with lymph nodes metastasis was higher than that without it（P＜0.05）.The over-expression of MMP-1protein in patients with invasion in deep muscular layer and adventitial layer was higher than that in mucosa and superficial muscular layer（P＜0.05），and higher inⅢ～Ⅳstages than inⅠ～Ⅱstage.Conclusion VM existed in ESCC and the over-expression of MMP-1protein may promote VM formation，lymph node metastasis and invasion.

Esophageal Squamous Cell Carcinoma；Matrix metalloproteinase-1；Vasculogenic Mimicry；Immunohistochemical Staining；Metastasis

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.010

2011-10-25

2011-12-06

安徽省高校優(yōu)秀青年人才基金（2009SQRZ130）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2011A203）；蚌埠醫(yī)學(xué)院基金（BY0801）

柴大敏，女（1981年），漢族，講師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）