李 艷 張端蓮 王 蘭 蔡麗華 吳慧芬 王燕舞桂志祥 梨 莉 談新提＊

Sal B對肝癌細(xì)胞株HepG2的促凋亡作用

李 艷1張端蓮1王 蘭2蔡麗華3吳慧芬3王燕舞桂志祥1梨 莉1談新提1＊

（1武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室；2武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，武漢430071；3鄂州市計(jì)劃生育服務(wù)站，湖北436000）

目的 揭示丹酚酸B（Salvianolic Acid B，Sal B）對肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用。方法 用不同濃度的丹酚酸B處理HepG2細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24h。用RT-PCR檢測促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄水平，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的水平。結(jié)果 ①100μmol／L、50μmol／L、25μmol／L等濃度的Sal B處理都能使 HepG2細(xì)胞促凋亡基因bax的轉(zhuǎn)錄水平升高，其中100μmol／L處理組最為明顯。②不同濃度的Sal B處理都能使HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中100μmol／L處理組最為明顯。結(jié)論 Sal B有促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的作用。

丹酚酸B；HepG2細(xì)胞株；Bax；凋亡

肝癌是一種世界上最常見的惡性腫瘤之一。在我國占居民惡性腫瘤死亡的第二位［1］。全世界每年新發(fā)肝癌約26萬例，占全部惡性腫瘤的4.0%，而42.5%的肝癌分布在中國，中國肝癌死亡率為20.4／10萬，占全部惡性腫瘤死亡的18.8%。由于肝癌起病比較隱匿，一經(jīng)確診往往已屬晚期，故只能進(jìn)行姑息性切除或放、化療［2］。療效也不理想。因此，臨床上肝癌病人急需特異性的、有效的新型的抗癌。凋亡（apoptosis）是程序性的細(xì)胞死亡。是細(xì)胞生理性死亡的普遍形式。機(jī)體內(nèi)總是有大量的細(xì)胞發(fā)生，同時也有無數(shù)的細(xì)胞凋亡，這樣維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡。平衡力量的任何一方不足，都可能引起機(jī)體發(fā)生疾?。?］。腫瘤發(fā)生的原因是相當(dāng)復(fù)雜的，其中一個重要原因可能是細(xì)胞凋亡的趨勢減弱［4］。因些，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，糾正失衡的機(jī)體內(nèi)環(huán)境，是抗腫瘤的一個重要方法。然而，細(xì)胞的凋亡受到很多種蛋白質(zhì)分子調(diào)控，這些蛋白質(zhì)大致可分為促凋亡和凋亡抑制兩種蛋白。前者如Bax等。后者如Bcl-2等［5］。凋亡抑制蛋白 Bcl-2是控制線粒體致凋亡因子釋放的主要調(diào)節(jié)因子。促凋亡蛋白則以非活性的形式定位分布于胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受到死亡信號刺激后，在某些蛋白酶的作用下促凋亡蛋白便發(fā)生構(gòu)象變化，從胞質(zhì)中易位到線粒體外膜上，并與膜上的凋亡抑制蛋白相互作用，使凋亡抑制蛋白喪失對細(xì)胞凋亡的抑制活性，引起細(xì)胞器功能喪失和各種促凋亡因子（如：細(xì)胞色素C）的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。

丹參（Savia miltiorrhiza）又名赤參，紫丹參，紅根等。為雙子葉植物唇形科，干燥根及根莖。是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥。在我國有數(shù)千年的使用歷史了?，F(xiàn)在也被美國、日本及一些歐洲國家所接納［7～9］。丹參有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養(yǎng)血安神之功效。近幾十年來，研究人員發(fā)現(xiàn)丹參對心血管病、慢性肝炎、肝硬化及腫瘤也有治療作用，且無負(fù)作用［1～15］。丹參在我國雖然使用了數(shù)千年，但人們對其有藥用價值的成分一直不是很清楚。最近50年人們才弄清它含有70多種有效成

分［9、16］。

丹酚酸B（Salvianolic Acid B，Sal B）是丹參有效成份中最豐富、最有生物活性的一個成分［5、17］。大 量 的 研 究 證 實(shí) Sal-B 能 抗 氧 化［18、19］、抗 凝血［20～22］、抗 炎［10、15、23］及 抗 腫 瘤 生 長［10、24～26］。 最 近的研究發(fā)現(xiàn)Sal-B能抑制頭頸部磷狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞株的生長［27］。

雖然有學(xué)者用人肝癌細(xì)胞株HepG2作為實(shí)驗(yàn)對象［5］，但主要是從細(xì)胞生長的角度研究Sal-B的影響。本論文則是從細(xì)胞凋亡的角度將Sal-B對HepG2的影響進(jìn)行了初步的探討。

材料和方法

1.材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2購于北京生物科技發(fā)展有限公司。Sal-B（純度﹥99%）購于中國藥品生物制品檢定所。小牛血清購于Hyclone公司。RPMI1640購于武漢博士德公司。DMSO購于武漢凌飛科技有限公司。Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC購于eBioxciene公司。目的基因Bax及內(nèi)參照β-actin的引物購于上海英駿生物技術(shù)有限公司。

2.方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10% 胎牛血清、100I.U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。2-3d傳代一次，當(dāng)細(xì)胞到達(dá)對數(shù)生長期時用于本實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 Sal B處理細(xì)胞

消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2.5×104／ml，用 96 孔板接種，每孔200μl；24h 后，實(shí)驗(yàn)組換溶于 DMSO（終濃度為0.2%）的 Sal B，藥物終濃度分別為100μmol／L、50μmol／L和25μmol／L，另設(shè)對照組（只加200μl細(xì)胞懸液），每組設(shè)5個復(fù)孔；繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用于2.3和2.5的實(shí)驗(yàn)。

2.3 RT-PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction）檢測Bax的轉(zhuǎn)錄水平

收集Sal B處理過HepG2細(xì)胞，用Trizol試劑抽提得到總RNA后，首先用DNAse消化，去除抽提物中殘存的DNA。然后以O(shè)ligo（dT）20為引物，按Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成cDNA，再用TaKaRa公司試劑盒擴(kuò)增目的DNA?；驍U(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃10sec，60℃10sec，72℃10sec，35個循環(huán)，最后于72℃延伸10min，保存于4℃。實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參照。目的基因Bax的引物根據(jù)GenBank中Bax基因（基因號：NM017059）用DNAMAN4.0程序設(shè)計(jì)。目的基因Bax及內(nèi)參照β-actin的引物序列為：Bax：sense：5＇-ACCAAGAAGCTGAGC GAGTGTC-3＇，antisense：5＇-GGCAGACCGTGACCATCTTTGT-3＇，Product：365bp；β-actin：sense：5＇-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3＇，antisense：5＇-GGC TGTATTCCCCTCCATCG-3＇，Product：154bp。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

配1×TBE電泳緩沖液300ml，3%瓊脂糖（Agarose）凝膠40ml。取出5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5μl（溴酚藍(lán)、二甲苯藍(lán)、蔗糖和EDTA）混合液，制成樣品。以樣品5μl、Marker 2μl的量上樣，電泳100V45min。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞凋亡的水平

收集Sal B處理細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106個／ml。取100μl細(xì)胞懸液，加入抗體，4℃孵育48h；離心，去上清，加入染色緩沖液洗2次，離心；去上清，加入100μl PBS重懸細(xì)胞，加入5μl Annexin V，室溫避光孵育15min離心，加入染色緩沖液洗2次，離心；去上清，加入200μl PBS重懸細(xì)胞，加入5μl PI，室溫避光孵育15min。流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoTMII，BD Biosciences）分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

結(jié) 果

1.Sal B促進(jìn)HepG2細(xì)胞Bax基因的轉(zhuǎn)錄

為了檢測Sal B對HepG2細(xì)胞bax基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，我們用不同濃度（100μmol／L、50μmol／L、25μmol／L）的 Sal B 處理細(xì)胞，并在37℃培養(yǎng)24h。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種濃度的Sal B都能引起HepG2細(xì)胞促凋亡基因bax的mRNA水平明顯升高，100μmol／L組的升高水平最為明顯；而對照組幾乎未檢測到mRNA（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測Sal B處理／未處理 HepG2細(xì)胞Bax基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 The level of Bax gene transcription of HepG2s treated with different concentration of Sal B or untreated was measured via RT-PCR.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測Sal B處理／未處理HepG2細(xì)胞細(xì)胞凋亡的水平Fig.2 The level of apoptosis of HepG2streated with different concentration of Sal B or untreated was measured through flow cytometry.

2.Sal B提高HepG2細(xì)胞的凋亡水平

為了檢測Sal B對HepG2細(xì)胞株凋亡水平的影響，我們用不同濃度的Sal B處理細(xì)胞后，再依次經(jīng)過Annexin V和PI處理細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，即使是最低濃度的Sal B處理的細(xì)胞，也會發(fā)生明顯的凋亡（P＜0.05）；高濃度組最明顯（P＜0.001）；而對照組，細(xì)胞凋亡水平很低（圖2）。

討 論

機(jī)體組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定依賴于細(xì)胞生長和細(xì)胞死亡之間的平衡，而人類腫瘤的發(fā)生正是這種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的失衡［4-1］。這也意味著程序性細(xì)胞死亡比例下降會引起腫瘤形成。因此，某些人類腫瘤的標(biāo)志是對刺激失去凋亡反應(yīng)的能力［4-3，4］。有鑒于此，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對凋亡刺激反應(yīng)的能力成為抗腫瘤的一個重要方法。

能引起細(xì)胞發(fā)生凋亡的刺激有很多［28］。有些刺激來自細(xì)胞外，如：死亡受體、化學(xué)藥物、抗體藥物。有些來自細(xì)胞內(nèi)，如：活性氧（reactive oxygen species，ROS），代謝終末產(chǎn)物。凋亡啟動的標(biāo)志是caspases激活。Caspases是一種半胱氨酸蛋白酶家族，在多種細(xì)胞死亡中發(fā)揮死亡效應(yīng)分子的作用［29］。Caspases以未激活的酶原形式合成，激活時會發(fā)生裂解并二聚化［29］。Caspases的激活有二條途徑：死亡受體（外）通路和線粒體（內(nèi)）通路［30］。在死亡受體通路，死亡受體通過與對應(yīng)的配體結(jié)合導(dǎo)致凋亡啟動分子 Caspase-8的激活［31］。Caspase-8一旦激活，要么直接裂解效應(yīng)Caspases如Caspase-3，或者通過裂解Bid激活線粒體通路。裂解后的Bid（如：tBid）依次轉(zhuǎn)移線粒體膜，并在膜上引起膜間蛋白（如：細(xì)胞色素C，Cytocrome C）釋放到細(xì)胞液 中［32，33］。 在 胞 液 中 細(xì) 胞 色 素 C 與 Apaf-1 和Caspase-9形成多聚復(fù)合物（凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物），引起Caspase-3的激活［33］。其中線粒體依賴性細(xì)胞凋亡通路是抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心通路［34］。細(xì)胞的凋亡受到很多種蛋白質(zhì)分子調(diào)控，這些蛋白質(zhì)大致可分為促凋亡和凋亡抑制兩種蛋白。前者如Bax、P53、Fas、Fasl等。后者如 Bcl-2、Bcl-xL、NF-κB、MDM-2等［5］。

Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，同屬于Bcl-2家族，具有21%的同源性，可通過形成同二聚體或異二聚體的方式來改變線粒體的通透性，從而決定細(xì)胞是生存還是死亡。不同細(xì)胞Bcl-2的定位不同，有些細(xì)胞分布于線粒體膜上，有的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，還有的位于核膜上，并通過抑制Cytocrome C釋放而發(fā)揮凋亡抑制作用［35］。Bax為促凋亡蛋白，常位于細(xì)胞液中，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，從胞液遷移到線粒體膜和核膜，拮抗 Bcl-2的凋亡抑制作用［34］。當(dāng)Bcl-2的相對量占優(yōu)勢時，Bcl-2／Bcl-2的量增多，促進(jìn)Bcl-2／Bax的形成，從而抑制細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bax的相對量占優(yōu)勢時，則Bax／Bax的量增多，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，Bcl-2和Bax兩者的比例是關(guān)系到細(xì)胞凋亡或存活的關(guān)鍵因素。

先用不同濃度的Sal B處理HepG2細(xì)胞，然后用RT-PCR檢測促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種濃度的Sal B都能引起HepG2細(xì)胞促凋亡基因bax的mRNA水平明顯升高，100μM組的升高水平最為明顯；而對照組幾乎未檢測到mRNA（圖1）。該結(jié)果提示與未用Sal B處理組相比較，隨著Sal B處理濃度的增加，促凋亡蛋白Bax mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。但這是否意味著Bax與Bax形成了同二聚體，是否真正啟動了細(xì)胞凋亡呢。我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)給出了回答。我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測了不同濃度Sal B處理的HepG2發(fā)生凋亡的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著Sal B處理濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比率也增加，而未用Sal B處理的細(xì)胞，凋亡率很低（圖2）。上述這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Sal B對人肝癌細(xì)胞株HepG2有促凋亡作用，可能是通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而使Bcl-2／Bax的比率增高，并使Bax從胞質(zhì)中易位到線粒體外膜上，與膜上的Bcl-2相互作用，使Bcl-2喪失對細(xì)胞凋亡的抑制活性，引起細(xì)胞器功能喪失和各種促凋亡因子（如：細(xì)胞色素C）的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。

本文證明了Sal B對人肝癌細(xì)胞株HepG2有促進(jìn)凋亡的作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，其殺傷腫瘤的確切機(jī)制還有待深入的研究。如前所述，Sal B是一種低毒性的天然藥物，具有巨大腫瘤治療藥物開發(fā)的價值。

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Sal B Promotes apoptosis of human liver cancer cell line HepG2

Li Yan1，Zhang Duanlian1，Wang Lan2，Cai Lihua3，Wu Huifen3，Wang Yanwu1，Gui Zhixiang1，Li Li1，Tan Xinti1＊
（1Department of Histology and Embryology ，Wuhan University；2Department of Immunology，Wuhan University ，Hubei 430071；3Family Planning station of Ezhou City，Hubei 436000，China）

ObjectiveTo reveal the effect of sal B to kill HepG2s.MethodsHepG2swere treated with different concentrations of sal B and were cultured at 37℃for 24hours.Then the transcription level of Bax gene of the cells was detected by reverse transcription polymerase chain reaction.The being the apoptosis level of the cells was analyzed with flow cytometry.ResultsThe transcription level of Bax gene of the cells treated with sal B was markedly improved，being the highest in 100μM sal B treated group.The numbers of apoptotic cells treated with sal B was increased，being the highest 100μM treated group.ConclusionSal B can promote the apoptosis of HepG2s.

Salvianolic acid B；HepG2；Bax；Apoptosis

R339.12＋2

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.003

2011-10-15

2011-12-01

湖北省衛(wèi)生廳人才基金資助（JX4B14）

李艷，女（1983年），漢族，碩士研究生。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）