耿 陽，牟小東，劉 然，邊葶藶，廖 敏，周繼勇

(浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物病毒學(xué)重點實驗室，杭州 310058)

雞的傳染性支氣管炎由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）感染引起，是一種高度接觸性傳染病，IBV可侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等[1]。由于IBV特殊的轉(zhuǎn)錄機制導(dǎo)致該病毒容易發(fā)生變異，造成的臨床特征越來越復(fù)雜。目前IBV的變異株廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

傳染性支氣管炎病毒與引起嚴重急性呼吸綜合癥（severe acute respiratory syndrome，SARS）的冠狀病毒（SARS-coronary virus, SARS-CoV）同屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員。這兩種病毒具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，其基因組編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）和15或16種非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein），在IBV沒有nsp1蛋白[2]。已有的研究表明，冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白與病毒的復(fù)制、增殖和致病力有關(guān)[3-6]。

nsp5是冠狀病毒的主要蛋白酶（main protease，Mpro）， 又稱 3C樣 蛋白酶（3C-like proteinase，3CLpro），對多聚蛋白的水解起關(guān)鍵作用，因此，nsp5成為抗SARS和其他冠狀病毒藥物研究的重要靶點[7]。目前對IBV非結(jié)構(gòu)蛋白的研究幾乎是一片空白，開展IBV非結(jié)構(gòu)蛋白研究對于揭示IBV的致病機制和尋求IBV新的檢測方法具有重要意義。本試驗利用基因工程技術(shù)重組表達了IBV nsp5蛋白，并證實其具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞及宿主菌 傳染性支氣管炎病毒SC021202毒株[8]、Sf9細胞、E.coliTOP10、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、E.coliDH10Bac由本實驗室保存。

1.1.2 載體與試劑 桿狀病毒表達載體pFastBac HTA、CellfectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑以及TRIzol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；T4 DNA連接酶及限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自于AxyGen公司；Ni-NTA親和純化試劑盒購自QIAGEN公司；鼠抗His單克隆抗體由本實驗室制備并保存；兔抗GST多抗血清、HRP標記羊抗鼠IgG以及HRP標記羊抗兔IgG均購自于KPL公司。

1.2 方法

1.2.1nsp5基因的擴增 根據(jù)IBV SC021202的基因組序列（GeneBank 登錄號： EU714029），設(shè)計擴增IBV SC021202nsp5上下游引物：IBVnsp5-F，5′-GGAATTCGCTGGTTTTAAGAAGCTAGTT TC-3′；IBVnsp5-R，5′-AGCGTCGACTCACTGT AGTCTGACAC-3′，引物分別帶有EcoR I和SalI酶切位點。以Trizol試劑從IBV SC021202感染的雞胚尿囊液中提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，PCR程序：95 ℃預(yù)變性4 min；然后進入94 ℃變性1 min，58℃退火30 s，72 ℃延伸1 min的循環(huán)，共進行30個循環(huán)；72 ℃再延伸6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，用試劑盒進行純化回收目的基因片段。將回收到的基因片段連接到pMD18-T質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶分析后送測序公司進行目的片段的測序分析，確定目的基因片段擴增的正確性。將序列測定正確的重組T質(zhì)粒命名為IBVnsp5-T。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建 純化回收經(jīng)EcoR I和SalI酶切載體IBVnsp5-T的目的基因片段連接到經(jīng)EcoR I和SalI酶切的pFastBac HTA轉(zhuǎn)移載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR和酶切分析正確的陽性重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA-IBVnsp5轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒基因組Bacmid的E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞，使轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒基因組發(fā)生同源重組。在選擇性LB平板（含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素、100 μg/mL X-gal和40 μg/mL IPTG）上進行藍白斑篩選。挑取白色克隆經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，分別用特異性引物和M13通用引物（M13上游引物：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13下游引物：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'），PCR鑒定帶目的片段陽性克隆。獲得的陽性質(zhì)粒命名為IBVnsp5-Bacmid。同樣方法構(gòu)建增強型綠熒光蛋白（enhanced green fluorescene protein,EGFP）重組質(zhì)粒EGFP-Bacmid作為參照。

1.2.3 重組蛋白表達 參照Invitrogen 公司CellfectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑說明書操作方法。將IBV nsp5-Bacmid和EGFP-Bacmid質(zhì)粒同時分別轉(zhuǎn)染Sf9細胞，待在熒光顯微鏡下可以觀察到大量綠色熒光蛋白表達時收集IBVnsp5-Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞上清液作為P0代重組病毒。P0代毒在Sf9細胞中傳代2次后，用間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescence assay, IFA）鑒定傳代過程中目的蛋白的表達情況，并收獲上清作為重組病毒于4℃保存，備大量接種細胞用。

1.2.4 重組蛋白鑒定 收獲重組桿狀病毒感染72 h后的Sf9細胞，經(jīng)PBS洗滌3次后，用適量的PBS懸浮細胞，超聲波裂解細胞后，加入等體積的2 ×SDS-PAGE上樣緩沖液進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后，以抗His單抗作為一抗，HRP標記的抗鼠IgG為二抗，按常規(guī)的Western blot檢測表達的蛋白。

1.2.5 重組蛋白的純化 重組桿狀病毒原液與Sf9細胞感作1 h后，棄去病毒液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)在37 ℃下孵育3～4 d后收獲細胞。按QIAGEN公司蛋白純化試劑盒純化His融合蛋白的方法純化重組蛋白。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析鑒定。用BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce Biotechnology）測定蛋白的濃度。

1.2.6 抗nsp5小鼠多抗血清的制備 純化的重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合，充分乳化，按100 μg/只蛋白的量經(jīng)腹腔免疫6～8周齡BALB/c小鼠（購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心）。此后每隔2周，相同的蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化后，以相同的劑量和方法加強免疫。免疫4次后，采血分離血清，通過IFA、（enzyme linked immunosorbene assay, ELISA）、Western blot鑒定抗體的產(chǎn)生。

圖1 nsp5基因的RT-PCR擴增Fig.1 Amplif i cation of nsp5 gene by RT-PCR

1.2.7 IBV感染細胞中nsp5蛋白的IFA檢測 IBV SC021202毒株感染96孔板培養(yǎng)的DF-1細胞48 h后，用4%甲醛固定30 min。經(jīng)含5%脫脂奶粉的PBS封閉1 h后，用1:100稀釋的抗nsp5的小鼠多抗血清與細胞于37℃孵育1 h，之后再用1:500稀釋的FITC標記的抗鼠IgG于37℃孵育1 h。反應(yīng)結(jié)束后熒光顯微鏡觀察并記錄結(jié)果。設(shè)未感染的DF-1細胞作對照。

2 結(jié)果

2.1 nsp5基因的擴增、克隆與重組質(zhì)粒的鑒定 以IBV SC021202 毒株感染的雞胚尿囊液抽提的RNA為模板，以IBVnsp5-F和IBVnsp5-R為引物，RT-PCR擴增出約900 bp的片斷（圖1）。將該片斷連接到pMD18-T載體，經(jīng)測序證明為921bp的IBV nsp5基因。

將純化獲得的nsp5亞克隆于桿狀病毒表達系統(tǒng)的pFastBac HTA載體，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA-IBVnsp5。此重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒基因組Bacmid的E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞，通過同源重組獲得桿狀病毒重組質(zhì)粒IBVnsp5-Bacmid。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化相應(yīng)E.coli后，挑取單菌落培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定，表明nsp5基因插入的位置、大小和閱讀框均正確。圖2為重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果。同樣的方法也成功構(gòu)建了作為參照用的EGFP重組質(zhì)粒（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identif i cation of recombinant plasmids by PCR

2.2 重組桿狀病毒的獲得及表達蛋白的純化和鑒定將IBVnsp5-Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞，同時EGFPBacmid也染轉(zhuǎn)Sf9細胞作為插入基因蛋白表達的參照。轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)上清作為傳代病毒在Sf9細胞傳2代后，再接種Sf9細胞，接毒后72 h，在顯微鏡下觀察到明顯的細胞病變。通過參照的重組EGFP桿狀病毒感染Sf9細胞的觀察，可見在轉(zhuǎn)染后12 h有微弱熒光，轉(zhuǎn)染24 h后熒光稍有加強，轉(zhuǎn)染48 h后可見熒光信號明顯加強，等到轉(zhuǎn)染96 h后，大約70%細胞內(nèi)可見到較強的綠色熒光（圖3A）。

根據(jù)EGFP表達的情況，IBVnsp5-Bacmid轉(zhuǎn)染細胞獲得的重組桿狀病毒接種Sf9細胞后96 h收獲感染的細胞。收獲的細胞固定后，以His單抗作為一抗，通過IFAT檢測感染細胞中目的蛋白的表達。結(jié)果觀察到IBVnsp5-Bacmid接毒的Sf9細胞出現(xiàn)了明顯的熒光反應(yīng)，而未接毒的Sf9細胞無熒光反應(yīng)，表明IBVnsp5-Bacmid轉(zhuǎn)染的Sf9細胞成功表達了His/His融合蛋白（圖3B）。

為了進一步確定重組病毒感染的細胞表達了重組的目的蛋白，將收獲的IBVnsp5-Bacmid重組病毒感染的Sf9細胞用超聲波裂解后，裂解產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)Western blot檢測，結(jié)果裂解產(chǎn)物與His單抗起特異性反應(yīng)，并在37 kDa左右的位置出現(xiàn)了反應(yīng)帶（圖3C），與預(yù)期的His和nsp5融合蛋白的分子量大小相符，說明了nsp5在Sf9獲得了順利表達。

利用融合蛋白帶有His標簽的特性，從感染細胞中純化了重組蛋白，純化的重組蛋白大小為預(yù)期的37 kDa左右（圖4A），并與His單抗發(fā)生反應(yīng)（圖4B）。

圖3 nsp5真核表達及鑒定Fig.3 Expression and identif i cation of nsp5 expressed in Sf9 cells

圖4 nsp5蛋白真核表達Fig.4 Expression of nsp5 in Sf9 cells

2.4 nsp5天然蛋白的檢測 IBV SC021202毒株感染DF-1細胞后，用純化的重組蛋白制備的nsp5多抗血清通過IFAT檢測感染的DF-1細胞是否表達天然的nsp5蛋白。結(jié)果可觀察到感染了IBV SC021202的DF-1細胞中出現(xiàn)了明顯的綠色熒光（圖5）。表明制備的抗血清可與天然的nsp5蛋白有良好的反應(yīng)性。

圖5 nsp5天然蛋白IFAT檢測Fig.5 Detection of native nsp5 by IFAT

3 討論

本研究選取高效的Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達了IBV的nsp5蛋白，在構(gòu)建nsp5重組病毒的同時也構(gòu)建EGFP重組病毒作為指示系統(tǒng)。EGFP的表達能容易通過熒光顯微鏡觀察到。EGFP成功表達一方面指示同時進行的目的基因的操作系統(tǒng)可行，另一方面，通過EGFP重組病毒感染細胞后的病變和蛋白表達情況也可以給nsp5重組病毒和感染細胞收獲時間以及表達蛋白檢測時間作參考。通過IFAT檢測發(fā)現(xiàn)，nsp5重組病毒感染的細胞與EGFP重組病毒感染的細胞類似，在感染96 h后，大部分的細胞都表達了目的蛋白，而且此時收獲細胞純化蛋白獲得的量也比較高。Western blot在鑒定感染細胞裂解物的蛋白時，出現(xiàn)兩條約37 kDa左右的反應(yīng)帶，可能是表達蛋白被糖基化，造成蛋白在SDS-PAGE膠中遷移率差異的結(jié)果。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)能在真核細胞表達與天然蛋白結(jié)構(gòu)接近的重組蛋白[9]。我們在真核細胞成功表達nsp5前，用原核系統(tǒng)表達了nsp5蛋白，但原核表達的蛋白制備的抗血清不能順利檢測到感染細胞的天然nsp5蛋白，而本研究中真核表達的蛋白制備的抗血清可檢測到天然的nsp5蛋白，表明了Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的優(yōu)越性。nsp5在Sf9細胞的成功表達和純化為進一步研究nsp5的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。目前對冠狀病毒nsp5的研究多集中在SARS冠狀病毒,小鼠肝炎病毒（MHV）等冠狀病毒的生物信息學(xué)、蛋白晶體結(jié)構(gòu)及其與其他蛋白相互作用的研究上[10，11]。對IBVnsp5蛋白功能的進一步研究可為SARS冠狀病毒等的研究提供借鑒。

目前在對IBV的基因分型、診斷以及致病機制研究等方面，主要基于對IBV的結(jié)構(gòu)蛋白尤其是S1基因的研究上。很少見到有應(yīng)用IBV的非結(jié)構(gòu)蛋白建立IBV診斷方法的報道。然而相對于S1基因，非結(jié)構(gòu)蛋白在不同的IBV變異株間更保守。序列分析表明IBV nsp5與經(jīng)典呼吸型毒株M41、H52以及腎型株SAIBK的氨基酸的同源性在90%～94%之間(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，建立基于非結(jié)構(gòu)蛋白的檢測方法對IBV的檢測更具普遍性。本文純化的蛋白制備的血清不僅與重組的nsp5蛋白起反應(yīng)，而且能檢測到IBV感染細胞中特異的nsp5蛋白，表明nsp5蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)性，可用于IBV抗原或抗體檢測方法的建立。

綜上所述，本文利用真核系統(tǒng)成功表達了nsp5蛋白，為病毒診斷抗原、抗體的開發(fā)以及nsp5蛋白的生物學(xué)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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