賈寶琴，焦培榮，韋良孟，單 芬，袁潤余，徐成剛，廖 明

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院 農業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州 510642）

禽流感 (avian influenza, AI)是由A型流感病毒引起的禽類一類急性高度接觸性傳染病[1]，該病在世界各地均有發(fā)展，并且對養(yǎng)殖業(yè)和人類的健康造成威脅。一些野生水禽，如鴨、鵝、天鵝等是流感病毒的天然宿主，在流感病毒的自然生態(tài)學中發(fā)揮著重要作用。H6亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)最早分離于鴨，后來發(fā)現也能夠傳播給雞[2,3]。雖然低致病性AIV（low pathogenic Avian influenza virus , LPAIV）沒有高致病性AIV（highyly pathogenic Avian influenza virus, HPAIV）危害性大，對其研究也相對較少，但是近幾年H6亞型AIV在中國和其他一些國家及地區(qū)的野鳥和家禽中廣泛存在，其流行和傳播趨勢呈上升趨勢[4]。1963年，加拿大最早從火雞中分離到H6N2亞型的禽流感病毒（A/turkey/Canada/63（H6N2））（見GenBank數據庫）。1977年香港從鴨中分離到H6N2亞型禽流感病毒（A/duck/Hong Kong/134/77（H6N2））。2000年2月，低致病性H6N2亞型禽流感在美國加利福尼亞暴發(fā)，從散養(yǎng)的家禽和商品雞均可分離出禽流感病毒[5,6]。研究表明，在1997年暴發(fā)的香港禽流感事件中，導致人感染死亡的H5亞型AIV的內部基因來源于香港地區(qū)的H6亞型AIV[7]。中國2000年已有關于H6亞型AIV分離鑒定的報道[4]，在人群中檢測到H6亞型AIV的特異性抗體[8]，表明該亞型病毒能夠感染人。

本次研究主要是對在中國廣東省進行分子流行病學時采集到的拭子中病毒進行分離鑒定，從而為更好地了解禽流感病毒的流行情況和宿主范圍等方面的研究提供數據，為我國更好地預防和控制禽流感的發(fā)生、流行提供試驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本和雞胚 2009年采自廣東省某活禽交易市場的100份雞源泄殖腔拭子樣本，由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院禽病研究室提供；10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.1.2 試 劑 AMV Reverse Transcriptase、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、載體質粒pMD18-T、工程菌JM109等購自大連寶生物工程公司；Trizol Reagent、RNase Inhibitor購 自 Invitrogen公 司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為天根生物科技有限公司產品；抗流感病毒標準陽性血清由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院禽病研究室提供；抗雞新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）及減蛋綜合征病毒的標準陽性血清由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院禽病室提供。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離及HA亞型鑒定 將采集的雞拭子按照世界動物衛(wèi)生組織推薦的標準方法處理后[9]，取上清液，經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL，37 ℃孵化48 h后，收集雞胚尿囊液，測定血凝價。將具有血凝價活性的雞胚尿囊液分別與抗NDV、減蛋綜合征病毒、H6亞型禽流感病毒的標準陽性血清進行血凝抑制（HI）試驗，具體操作程序按照世界動物衛(wèi)生組織推薦的標準方法進行[9]，將鑒定過的病毒純化并分裝，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒特異性片段的RT-PCR擴增以及序列測定1.2.2.1 引物設計 參考GenBank數據庫中禽流感病毒序列設計針對M基因、HA基因、NA基因特異性鑒定引物，HA和NA基因全長擴增引物，以及流感病毒反轉錄通用引物Uni-12。引物由上海英駿公司合成，引物序列略。

1.2.2.2 病毒RNA的提取與RT-PCR 取1.2.1獲得的250 μL病毒尿囊液，加入750 μL Trizol Reagent RNA提取液，按照說明書提取病毒總RNA。用流感病毒反轉錄通用引物Uni-12，按照AMV反轉錄酶使用說明書進行反轉錄，合成的cDNA直接用1.2.2.1設計的特異性引物進行PCR擴增，PCR產物純化回收并測序。另外，RT-PCR鑒定時設有陰性對照組，以去離子水為模板用M、HA、NA鑒定引物進行擴增。

1.2.2.3 基因克隆和測序 將1.2.2.2獲得的全長HA、NA基因特異性PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，連接產物轉化至JM109感受態(tài)細胞，經鑒定的陽性重組質粒送深圳華大基因公司進行序列測定，測得序列與GenBank中流感病毒的HA和NA基因序列進行BLAST分析。

2 結果與討論

2.1 病毒的分離及鑒定 拭子樣品接種雞胚后觀察至48 h沒有出現死胚，收集雞胚尿囊液，發(fā)現其中編號為65和C7的兩份拭子的尿囊液能夠凝集雞紅細胞，血凝價達到9log2?？筃D病毒和減蛋綜合征76病毒的標準陽性血清不能夠對該病毒血凝產生抑制作用，而抗H6亞型禽流感病毒標準陽性血清能夠產生抑制作用，血凝抑制效價達到8log2，從而表明這兩份尿囊液含有H6亞型禽流感病毒。

2.2 特異性鑒定引物PCR擴增結果 分別用針對禽流感病毒M基因、H6亞型禽流感病毒HA基因、N2亞型禽流感病毒的NA基因的特異性鑒定引物對65號分離物和C7分離物的cDNA產物進行PCR擴增，依次獲得大小為299、1744、 1466 bp的特異性擴增片段（見圖1）。

圖1 分離株的M、 HA、 NA基因RT-PCR擴增產物Fig.1 RT-PCR products of M , HA and NA gene of the isolates

2.3HA、NA基因的序列測定及分析 獲得的HA和NA基因片段大小分別在1744 bp和1466 bp，與預期的大小相符，圖略。將測得的HA和NA基因序列經 DNASTAR Version 7.1 （Madison，WI，USA）軟件包中的Seqman軟件校對正確無誤后，登錄GenBank進行Blast分析，各基因與GenBank中核苷酸序列相似性最高的毒株列于表1。

表1 分離毒株與GenBank中核苷酸序列相似性最高的毒株Table 1 The isolates with the highest homdogy with 65 and c7 in GenBank

從表1中可以看出分離株65的HA基因核苷酸序列與汕頭鴨源分離株 A/duck/Shantou/339/2000（H6N2）的核苷酸序列相似性最高，達到95%，而NA基因與海南鴨源分離株A/duck/Hainan/4/2004（H6N2）的核苷酸序列相似性達95%。分離株C7的HA基因核苷酸序列與汕頭鴨源分離株A/duck/Shantou/2472/2005（H6N2）的核苷酸序列相似性最高，達到97%，而NA基因與汕頭鴨源分離株A/duck/Shantou/2472/2005（H6N2）的核苷酸序列相似性最高，達到95%。綜上所述，該兩分離株鑒定為H6N2亞型雞源禽流感病毒，根據禽流感病毒通用命名法則分別命名為A/Chicken/Guangdong/65/2009（H6N2）、A/Chicken/Guangdong/C7/2009（H6N2）。

2.4 H5亞型HPAIV的高死亡率，以及H9亞型LPAIV在家禽中的廣泛存在，使得這兩種亞型的AIV一直受到人們的普遍關注。H6亞型AIV由于為低致病性病毒，雖然近年來不斷有H6N1和H6N2亞型AIV疫情的報道[10-13]，但由于其發(fā)病率較低，一直沒有引起人們重視。然而，H6亞型禽流感病毒不僅可以向H5亞型高致病性禽流感病毒（HPAIV）和H9N2亞型禽流感病毒提供內部基因片段，而且還可以感染鼠和雪貂[14]，甚至人[8]。

近年來，隨著AIV在全世界范圍的流行，病毒的變異也日漸加強，HPAIV 對人類的危害性也日益增大。這也提示我們，在宿主混合感染LPAIV的條件下，有可能引起AIV發(fā)生基因突變和重組，改變HPAIV的生物學特性，增加HPAIV防控的難度。有研究曾指出,北美與歐洲部分地區(qū)的鴨群中H3 、H4 及H6亞型流感病毒的分離率最高，因此H6亞型LPAIVs的公共衛(wèi)生意義應予以重視。開展H6亞型病毒的分子流行病學和生物學特性研究，對于進一步評價H6亞型AIV對當前我國養(yǎng)禽業(yè)的危害、在高致病性AI防控體系中對H5亞型AIV的變異方面所起的作用，以及加強我國AIV的綜合防控有著重要的意義。

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