曾嘉梅，房 棟，卞學兵，王俊樺，顏 焰，周繼勇,2

（1.浙江大學 農業(yè)部動物病毒學重點實驗室，杭州 310058;

2.浙江大學 傳染病診治國家重點實驗室，杭州 310003）

禽流感病毒（Avain influenza virus, AIV）屬于正粘病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒，基因組為8節(jié)段單股負鏈RNA。根據禽流感病毒囊膜表面糖蛋白HA和NA抗原性的不同，可將禽流感病毒分為16個HA亞型和9個NA亞型[1,2]?；蛑亟M是流感病毒逃脫宿主已經獲得的免疫從而造成流行的重要方式，如1957年（A/H2N2）、1968年（A/H3N2）、1997年（A/H5N1） 和 2009年（A/H1N1）的流感大爆發(fā)[3-5]，而流感病毒的混合感染是實現其基因重組的有效途徑，不同亞型的流感病毒共同感染同一個宿主，它們在復制增殖時基因組可發(fā)生片段交換，從而產生出致病力不可預測的新型病毒，為流感病毒的大流行提供可能。

近年來，國內外多次報道流感病毒混合感染人的病例，但家禽混合感染事件報道甚少，本研究旨在分析免疫雞群H5N1和H9N2亞型禽流感病毒混合感染后基因組變化，以了解混合感染中有無分子特征的改變，為預防和控制禽流感的流行提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 SPF雞胚與標準血清 SPF種蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；雞H5N1高免血清（HI=9log2）由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所陳化蘭研究員饋贈；其他H1～H13標準陽性雞血清由中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院劉金華教授惠贈。

1.2 病料來源 病死雞肺組織來源于浙江省余姚市禽病防治研究所。調查中，雞群發(fā)病前免疫接種針對H5N1禽流感病毒的Re-4和Re-5疫苗及針對H9N2病毒的F株疫苗，三免后雞群H9N2和H5N1抗體水平均高于6log2。

1.3 引物合成與RT-PCR檢測 根據GenBank數據庫中禽流感病毒的HA和NA序列，在保守區(qū)設計鑒別H5N1和H9N2亞型的特異性引物（表1），引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。取肺組織按1:3（V/V）加入MEM后進行勻漿，組織勻漿經120 000×g離心15 min后取上清，使用Trizol LS Regent（Invitrogen公司）提取RNA，參照Fermentas Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit操作說明，使用Uni12引物通用引物（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）進行反轉錄，將得到的cDNA通過特異性引物進行PCR擴增以鑒定亞型。

表1 禽流感病毒亞型鑒定引物Table 1 Primers for subtype identify of Avian inf l uenza virus

1.4 病毒分離 病死雞肺組織勻漿上清與等量的H5N1禽流感病毒高免血清混合后，放于4 ℃冰箱中和過夜，接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，觀察雞胚死亡時間，96 h內未死亡的雞胚4 ℃冷凍收胚。收集雞胚尿囊液，用不同亞型禽流感病毒血清進行血凝抑制試驗。

1.5 基因片段的克隆及其測序 使用禽流感病毒基因組特異性引物（表2），PCR擴增H9N2病毒的全基因組片段，PCR產物經瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Axygen公司）回收后，連接至pMD18-T載體（TaKaRa公司），連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆送至上海博尚生物技術有限公司測序。

1.6 序列分析 應用Omiga軟件分析序列，推導編碼的氨基酸序列，應用Clustalx軟件比對得到的序列，應用MEGA 5.0軟件繪制各基因的系統進化樹。

2 結果與討論

2.1 混合感染的RT-PCR檢測 取肺組織病料上清提取病毒總RNA，經反轉錄后，使用流感病毒H1-H16和N1-N9的亞型特異性引物進行病毒亞型鑒定，PCR顯示擴增出H5A、H9A、N1A和N2A片段（圖1），再將4個PCR產物送至上海博尚生物技術有限公司測序。測序結果表明，病料中含有H5N1和H9N2亞型的HA和NA基因片段，說明病料含有H5N1和H9N2亞型禽流感病毒。經NCBI Blast比對，H5A片段序列與A/oriental magpie robin/Hong kong/9298/2009毒株的同源性最高，為98.6%，進化分析顯示混合感染病毒中H5N1毒株屬于clade 2.3.2。

表2 H9N2亞型流感病毒基因組擴增引物Table 2 Primers for amplif i cation of the eight genes of H9N2 subtype Avian inf l uenza virus

圖1 病料HA和NA基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplif i cation of HA and NA genes for AIV

2.2 病毒分離與鑒定 取病料上清與等量的H5N1亞型禽流感病毒高免血清混合后，置于4 ℃冰箱中和過夜。病料接種SPF雞胚36 h后出現雞胚死亡，死亡雞胚的尿囊液能凝集雞的紅細胞。血凝抑制試驗結果顯示，分離病毒的血球凝集特性能被禽流感病毒的H9亞型陽性血清抑制，而不被其他亞型的禽流感病毒陽性血清抑制，使用分子生物學方法采用流感病毒亞型鑒定引物，PCR只擴增出H9A和N2A片段（圖2），表明所分離的病毒為H9N2亞型禽流感病毒，命名為A/chicken/Yuyao/01/2010（H9N2）。

圖2 H9N2病毒鑒定結果Fig.2 PCR identif i cation results of H9N2 virus

2.3 H9N2病毒全基因組分子特征 PCR擴增H9N2亞型禽流感病毒的全基因組片段，PCR產物經1%凝膠電泳檢測，結果見圖3。A/CK/YY/1/10的HA蛋白的裂解位點為PSRSSR/GL，為低致病性禽流感病毒的特征，影響HA受體結合特性的位點，183N、190A、226L、228G，其226位出現人源流感病毒結合位點[6]。A/CK/YY/1/10的NA蛋白在莖部63～65位缺失3個氨基酸，為Ck/BJ/1/94-Like譜系的毒株的特征。研究顯示，流感病毒NS1蛋白中P42S、D92E和V149A這3個突變被認為與H5N1病毒在人和雞毒力增強有關[7]，A/CK/YY/1/10的NS1蛋白在這3個位點的氨基酸分別為42S、92D和149A。此外，由于NS1核苷酸C652T的突變形成終止密碼子TAG，致使NS1蛋白羧基端缺失了13個氨基酸，缺失了ESEV序列，進而失去了PDZ蛋白結合能力。流感病毒M2蛋白中的V27A和S31N的突變被認為是與流感病毒抵抗金剛烷胺密切相關[8]，A/CK/YY/1/10的M2蛋白26～34位氨基酸為LVVAANIIG，其31位發(fā)生了S31N的突變，27未有V27A的突變，表明其對金剛烷胺的抵抗能力有所增強。流感病毒PB2蛋白中E627K和D701N的突變被認為與禽流感病毒適應哺乳動物及其增強其對哺乳動物的感染能力和致病性有關[9]，A/CK/YY/1/10的PB2蛋白在這兩個位點分別為627E和701D。

圖3 H9N2病毒的全基因組片段Fig 3 RT-PCR products of H9N2 genome

2.4 H9N2病毒各基因的進化分析 參照Guan等[10]對H9N2亞型禽流感HA基因的分類標準，可以分為北美譜系和歐亞譜系，其中歐亞譜系又可以細分為3個譜系，分別以A/Chicken/Beijing/1/94、A/Quail/Hong Kong/G1/97和A/Duck/Hong Kong/Y439/97為代表毒株。A/CK/YY/1/10屬于A/Chicken/Beijing/1/94-Like譜系（圖4），這一譜系是近十年來中國地區(qū)的主要流行毒株，此病毒與 A/chicken/Zhejiang/HJ/2007、A/chicken/Anhui/WBQ/2011等構成一小分支，它們之間的同源性為94.5%～99.4%，而與BJ/1/94-Like譜系中其他毒株的同源性為87.2%～92.4%。依據Li等[11]對我國分離得到的H9N2病毒的進化分析結果為參照，A/CK/YY/1/10的NA、NS屬于BJ/1/94-Like譜系，M、PB2屬于G1-Like譜系，NP、PB1和PA屬于SH/F/98-Like譜系，這些結果顯示A/CK/YY/1/10為一重排病毒。

圖4 H9N2毒株的 HA基因進化樹Fig.4 Phylogentic tree of H9N2 HA gene

2.5 本次分離鑒定的A/chicken/Yuyao/01/2010（H9N2）的HA基因與近些年華東地區(qū)分離到的A/chicken/Zhejiang/SXY/2010（H9N2）（99.4%）、A/chicken/Anhui/WBQ/2011（H9N2）（99.4%）和 A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2）（98.5%） 病毒株同源性很高，其內部基因除了PB2以外，均與A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2）的同源性最高（>98%）， 但 是PB2與A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2）的同源性較低（82.9%）。因此，A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2） 可 能 為 A/CK/YY/01/10提供了除PB2以外的大部分基因，結合A/CK/YY/01/10毒株的8個基因片段分別隸屬于Ck/BJ/1/94-Like、Ck/SH/F/98-Like和 G1-Like三 個不同的譜系，推測A/chicken/Yuyao/01/2010（H9N2）毒株基因譜系的多樣化可能是多種譜系的H9N2病毒共同感染而造成的多片段重組所致。

混合感染病毒中H5N1屬于2.3.2分支， Re-4/5流感疫苗HA基因分別為第7分支和2.3.4分支，與2.3.2分支病毒具有較大差異，H9N2病毒HA基因與疫苗F株存在10.3%的核苷酸差異。調查中，免疫雞群H9N2和H5N1的抗體水平均高于6log2，出現雞群發(fā)生H5和H9N2亞型的混合感染，進一步表明該雞場環(huán)境中流行的H5N1和H9N2禽流感病毒與疫苗有抗原性差異，以致免疫后不能有效抵抗野毒的感染，提示國內禽流感新型疫苗的研制刻不容緩。通過對混合感染中的H9N2病毒全基因組測序和使用RDP3.44軟件[12]對H9N2病毒的基因組分析，雖然沒有在混合感染的H9N2病毒中發(fā)現H5N1的基因片段，但必須對禽流感病毒的混合感染現象加以重視和警惕，以防止通過混合感染而產生新的病毒。流感病毒基因組的分節(jié)段特性為不同亞型流感病毒在共同感染一個宿主時發(fā)生基因重組產生新型病毒提供了機會。據報道，新型流感病毒的表面糖蛋白與現有宿主的免疫系統具有很弱的血清學反應[13,14]，這種抗原漂移被認為是1957年（A/H2N2）和1968年（A/H3N2）的全球流感大爆發(fā)的原因[3,4]。

[1] Webster R G, Bean W J, Gorman O T,et al.Evolution and ecology of influenza A viruses[J].Microbiol Rev, 1992,56(1): 152-179.

[2] Fouchier R A, Munster V, Wallensten A,et al.Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls[J].J Virol, 2005, 79(5): 2814-2822.

[3] Li K S, Guan Y, Wang J,et al.Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia[J].Nature, 2004, 430(6996): 209-213.

[4] Neumann G, Chen H, Gao G F,et al.H5N1 influenza viruses: outbreaks and biological properties[J].Cell Res,2010, 20(1): 51-61.

[5] Garten R J, Davis C T, Russell C A,et al.Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1)influenza viruses circulating in humans[J].Science, 2009,325(5937): 197-201.

[6] Hensley S E, Das S R, Bailey A L,et al.Hemagglutinin receptor binding avidity drives influenza A virus antigenic drift[J].Science, 2009, 326(5953): 734-736.

[7] Jackson D, Killip M J, Galloway C S,et al.Loss of function of the influenza A virus NS1 protein promotes apoptosis but this is not due to a failure to activate phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)[J].Virology, 2010,396(1): 94-105.

[8] Schnell J R, Chou J J.Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus[J].Nature, 2008,451(7178): 591-595.

[9] Ping J, Dankar S K, Forbes N E,et al.PB2 and hemagglutinin mutations are major determinants of host range and virulence in mouse-adapted influenza A virus[J].J Virol, 2010, 84(20): 10606-10618.

[10] Guan Y, Shortridge K F, Krauss S,et al.H9N2 influenza viruses possessing H5N1-like internal genomes continue to circulate in poultry in southeastern China[J].J Virol,2000, 74(20): 9372-9380.

[11] Li C, Yu K, Tian G,et al.Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].Virology, 2005, 340(1): 70-83.

[12] Martin D P, Williamson C, Posada D.RDP2:recombination detection and analysis from sequence alignments[J].Bioinformatics, 2005, 21(2): 260-262.

[13] Salomon R, Webster R G.The influenza virus enigma[J].Cell, 2009, 136(3): 402-410.

[14] Smith G J, Fan X H, Wang J,et al.Emergence and predominance of an H5N1 influenza variant in China[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(45): 16936-16941.