孫春清，鄧 宇,2，張宏彪,3，龍進(jìn)學(xué)，韋祖樟，童光志，袁世山

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西昌 615000；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）與豬瘟病毒（Hog cholera virus, HCV）、羊邊界病病毒（Border disease virus，BDV）同屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus）的成員[1]，分為兩個(gè)基因型，即BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ。BVDV 最早由Olafon等報(bào)道于美國(guó)[2]，現(xiàn)在已經(jīng)遍布于世界各國(guó)，但是BVDV-Ⅱ的報(bào)道較晚，最早報(bào)道見(jiàn)于20世紀(jì)80年代晚期一次北美急性爆發(fā)[3]，隨后在南美洲、德國(guó)、比利時(shí)，意大利、澳大利亞、日本、韓國(guó)和印度等國(guó)均有該病的報(bào)道[4-6]。BVDV能引起感染動(dòng)物產(chǎn)生一系列復(fù)雜的臨床癥狀，包括腹瀉、粘膜病、持續(xù)感染與免疫耐受、繁殖障礙、血小板減少與出血綜合征等。BVDV除引起牛病毒性腹瀉，急、慢性粘膜病，免疫耐受和持續(xù)性感染，免疫抑制，母畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎外，還可引起羊、鹿和豬等動(dòng)物感染發(fā)病。豬感染BVDV可出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化[7-10]，已逐漸引起許多國(guó)家，尤其是已經(jīng)消滅或控制了豬瘟國(guó)家的關(guān)注。

BVDV在豬群中流行廣泛。據(jù)報(bào)道，澳大利亞、愛(ài)爾蘭、德國(guó)等國(guó)家豬群中BVDV抗體的陽(yáng)性率達(dá)3%～40%，荷蘭達(dá)15%～20%[11，12]。王新平等[13]于1996年首次從疑似豬瘟病料中檢出BVDV。2008年宋永峰等[14]利用PCR方法檢測(cè)了浙江、安徽、湖南、江西、廣西、遼寧等省的43份豬病料，陽(yáng)性率為16.3%。母豬感染BVDV會(huì)導(dǎo)致繁殖障礙、產(chǎn)仔數(shù)下降和流產(chǎn)；先天性感染的仔豬出生后可產(chǎn)生BVDV抗體，會(huì)形成持續(xù)性感染和免疫耐受，可長(zhǎng)期帶毒、并且可將BVDV傳播給易感的母豬[10]。目前該病毒對(duì)豬體的危害及致病機(jī)理尚不明確，尚需進(jìn)一步研究。在本次研究中，將已分離到的BVDV-1型SD0803毒株在MDBK細(xì)胞上連續(xù)傳40代，為研制豬源BVDV疫苗做好了物質(zhì)儲(chǔ)備，為進(jìn)一步研究其致病性和抗原性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒 BVDV SD0803毒株為2008年8月從山東某豬場(chǎng)疑似豬瘟發(fā)病仔豬的全血、腎臟、肝臟、淋巴結(jié)、脾臟等樣品中研磨分離得到，鑒定為非致病型 BVDV-Ⅰ[15]。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 MDBK細(xì)胞，購(gòu)于美國(guó) ATCC（American type culture collection，ATCC），經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室建立的套式PCR檢測(cè)為BVDV陰性。細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%馬血清的1640培養(yǎng)基，維持液為含2%馬血清的1640培養(yǎng)基，病毒稀釋液為無(wú)血清的1640培養(yǎng)基。QIAGEN cador BVDV Type 1/2 RT-PCR Kit購(gòu)自QIAGEN公司；Reverse Transcriptase XL、dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；pGEM-T載體、病毒RNA提取試劑盒、Top10感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA Ligase購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA片段膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自東盛科技股份有限公司；馬血清、PBS購(gòu)自Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，三者經(jīng)檢測(cè)BVDV抗原抗體均呈陰性；抗BVDV E2單克隆抗體為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所涂長(zhǎng)春教授惠贈(zèng)；TOPO載體、羊抗鼠二抗購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 SD0803病毒在MDBK細(xì)胞上的培養(yǎng)與傳代用含10%馬血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，按1:5傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將SD0803病毒原液按1:10稀釋接種，每個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種300 μL稀釋后的毒液，于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后換液，用含2%馬血清的1640培養(yǎng)液維持生長(zhǎng)，培養(yǎng)60 h后收取細(xì)胞上清，并以同樣的方法傳下一代，將病毒傳至第40代，將收取的第1、10、20、30、40代細(xì)胞上清保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 套式PCR 根據(jù)已發(fā)表的BVDV SD0803毒株全序列，選擇BVDV變異性較大的E2結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域[16]，利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物，由上海杰李生物技術(shù)公司合成。引物序列見(jiàn)表1。取250 μL病毒液，按天根病毒RNA提取試劑盒上的方法提取病毒RNA。隨后進(jìn)行cDNA的合成，在RT反應(yīng)體系中加入1 μL第一輪擴(kuò)增的下游引物、4 μL 5×AMV buffer、2 μL 10 mmol/l dNTPs、1 μL RNAsafe 、1μL AMV（10U,TaKaRa）、11μL RNA提取液，總體積20 μL。42 ℃溫浴l h，在冰水中冷卻2 min，-20℃保存。合成cDNA后，接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：5 μL 10×PCR bufer、5 μL dNTP、上游下游引物各1 μL、cDNA模板2 μL、LATaq酶1 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)至總體積50 μL，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；第二輪PCR反應(yīng)：95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)。

1.5 間接免疫熒光檢測(cè)(indirect immunofluorescence assay, IFA) 按1.3中所述將第10、20、30和40代病毒分別感染MDBK細(xì)胞，60 h后用冰甲醇固定細(xì)胞，室溫作用10 min；用PBS洗細(xì)胞2遍，加入適量1:100稀釋的抗BVDV E2單克隆抗體，室溫作用1.5 h；再用PBS洗2遍，再加入適量1:800稀釋的的二抗(綠色熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗)室溫作用1 h；PBS洗3遍，然后在細(xì)胞孔中加入PBS溶液。置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并拍照保存。

1.6 SD0803第40代毒株病毒全長(zhǎng)基因組的擴(kuò)增與克隆 根據(jù)BVDV SD0803親本序列利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)合成5對(duì)特異性引物，每對(duì)引物擴(kuò)增的片段與下一段均有重疊，由上海杰李生物技術(shù)公司合成。引物序列見(jiàn)表1。取250 μL病毒液，按天根病毒RNA提取試劑盒上的方法提取病毒RNA。

將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，其體系：1 μL第一輪擴(kuò)增的下游引物、4 μL 5×AMV buffer、2 μL 10 mmol/L dNTPs、1 μL RNAsafe 、1 μL AMV（10U, TaKaRa）、1 μL RNA提取液，42 ℃溫浴l h，在冰水中冷卻2 min。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，在反應(yīng)體系中依次加入5 μL 10×PCR bufer、5 μL dNTPs、上游下游引物各1μL、cDNA模板2 μL、pfuⅡ高保真酶1μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)至總體積50 μL，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。第一段產(chǎn)物：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；第二段產(chǎn)物：95 ℃變性 30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；第三段產(chǎn)物：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；第四段產(chǎn)物：95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；第五段產(chǎn)物：9 5℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增片段用東盛試劑盒純化回收后，與TOPO載體連接，構(gòu)建載體與片段的重組質(zhì)粒，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，將陽(yáng)性克隆送上海杰李生物技術(shù)公司測(cè)序。

利用DNASTAR軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并用SeqMan軟件拼接全長(zhǎng)序列，將拼接序列與親代病毒比對(duì)分析。

1.7 用Real-time PCR進(jìn)行病毒定量及病毒多步生長(zhǎng)曲線的繪制

1.7.1 構(gòu)建并稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 按照QIAGEN cador BVDV Type 1/2 RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)中反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對(duì)BVDV-Ⅰ型陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行Real-time PCR，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到pGEM-T載體，并進(jìn)行序列測(cè)定。將所得陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)濃度，按倍比梯度稀釋方法獲得標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7.2 絕對(duì)定量PCR法定量各代次病毒RNA拷貝數(shù) 以1.7.1制備的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，定量 P1、P10、P20、P30、P40代病毒RNA的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)的計(jì)算公式如下：樣本分子量=堿基數(shù)×324，待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/μL）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014。

1.7.3 生長(zhǎng)曲線的繪制 根據(jù)定量結(jié)果，P1、P10、P20、P30、P40代病毒以相同低感染劑量（0.1 MOI）接種MDBK細(xì)胞，分別在不同的時(shí)間段（0、12 、24 、36 、48 、60 、72 、84 、96 、108 、120h）收取200 μL細(xì)胞上清，同時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基，收取的上清在-70℃凍存，在收取完后提取細(xì)胞上清中病毒總RNA，按照QIAGEN cador BVDV Type 1/2 RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)中反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行絕對(duì)定量PCR反應(yīng)，利用7500 System Software軟件，計(jì)算各代次病毒的RNA拷貝數(shù)，并繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 病毒傳代及鑒定結(jié)果 為了研究BVDV在MDBK 細(xì)胞中的生長(zhǎng)特性，將以前分離獲得的SD0803株作為親本毒株在MDBK細(xì)胞連續(xù)傳代，每十代建立病毒種（stock），并通過(guò)套式PCR和IFA方法鑒定病毒的復(fù)制效率。套式PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示為1400 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期大小一致，測(cè)序結(jié)果也證實(shí)該片段為BVDV E2區(qū)域片段。IFA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒傳代的細(xì)胞內(nèi)（10、20、30和40代）可觀察到特異綠色熒光（圖2）。兩者均表明病毒在MDBK細(xì)胞上能夠持續(xù)傳代。

圖1 第20代和40代病毒基因組套式PCR電泳圖Fig.1 Nested-PCR products of P20 and P40 virus

圖2 親代病毒、P1、P10、P20、P30、P40傳代病毒的IFA鑒定（100×）Fig.2 IFA results of MDBK cells infected with parental virus, P10, P20, P30 and P40, respectively（100×）

2.2 病毒多步生長(zhǎng)曲線的繪制 為了鑒定傳代病毒（10、20、30和40代）在傳代細(xì)胞中的復(fù)制效率，將各代次的傳代病毒分別接種MDBK細(xì)胞，分時(shí)段收取上清，用qRT-PCR的方法鑒定各個(gè)時(shí)段（12、24、48、72、96 h）細(xì)胞上清中病毒基因組RNA拷貝數(shù)，并繪制多步生長(zhǎng)曲線。如圖3所示，各個(gè)代次的病毒有著相似的生長(zhǎng)特性，并在培養(yǎng)48 h達(dá)到繁殖高峰，48 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，第1、10代病毒毒力稍較低，20、30、40代毒株復(fù)制效率基本一致。說(shuō)明病毒傳代過(guò)程中生長(zhǎng)特性沒(méi)有改變，適應(yīng)在MDBK細(xì)胞中繁殖。

圖3 SD0803 P1、P10、P20、P30和P40病毒多步生長(zhǎng)曲線Fig.3 Multi-step growth curves of SD0803 P1, P10, P20, P30 and P40

2.3 SD0803 P40毒株病毒基因組的全長(zhǎng)擴(kuò)增及序列比對(duì)分析 為了確定BVDV細(xì)胞適應(yīng)株的基因組序列，通過(guò)分段擴(kuò)增克隆和測(cè)序?qū)θL(zhǎng)基因組進(jìn)行序列分析。通過(guò)設(shè)計(jì)5對(duì)引物，如圖4所示，分五段擴(kuò)增BVDV P40全長(zhǎng)基因組，得到的RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為2713 bp、3987 bp、2074 bp、3577 bp和2078 bp。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，并克隆到pCR-TOPO載體中，利用表1 的測(cè)序引物和載體通用引物將克隆進(jìn)行正反向測(cè)序，根據(jù)各擴(kuò)增片段的重疊序列利用DNAstar軟件對(duì)序列拼接，獲得BVDV P40的全長(zhǎng)基因組序列。

通過(guò)DNAstar軟件對(duì)SD0803 P40代與親代病毒兩者核苷酸及氨基酸同源性比較，我們發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的同源性為99.8%，氨基酸序列的同源性為99.6%。共有23個(gè)核苷酸發(fā)生突變，其中14個(gè)為有義突變且對(duì)應(yīng)12個(gè)氨基酸突變，主要集中在E2和NS5B區(qū)域：2個(gè)突變位于E1，3個(gè)突變位于E2，3個(gè)位于NS2-3，2個(gè)位于NS5A，4個(gè)位于NS5B。傳代過(guò)程中非結(jié)構(gòu)蛋白NS2～3區(qū)沒(méi)有外源序列的插入，3'UTR和5'UTR均未發(fā)生堿基序列的缺失、插入及突變（表2、表3）。說(shuō)明病毒適應(yīng)細(xì)胞繁殖的過(guò)程中，病毒的基因組也發(fā)生了一些變異。

圖4 分5段擴(kuò)增第40代病毒全長(zhǎng)基因組Fig.4 PCR products of P40 full-length genome

表1 測(cè)序及PCR引物Table 1 Primers used for PCR amplif i cation and sequencing

（續(xù)表）

3 討論

豬感染BVDV已經(jīng)引起有關(guān)國(guó)家，尤其是已經(jīng)消滅或控制了豬瘟的國(guó)家的關(guān)注。由于在中國(guó)該病發(fā)病并不高，且多伴有持續(xù)感染和免疫耐受等隱性感染，因此一直未引起養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)該病防治的重視。該病可通過(guò)牛血清傳染，所以存在疫苗污染問(wèn)題。我國(guó)目前還沒(méi)有對(duì)應(yīng)的BVDV疫苗應(yīng)用，曾經(jīng)用Oregon C 弱毒株和豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防該病，取得了一定的效果，但弱毒疫苗的安全性問(wèn)題仍不明確，因此并沒(méi)有推廣。從畜群中分離出優(yōu)秀的候選毒株用于疫苗研制，對(duì)于BVDV的防控是一個(gè)有效的途徑之一。

本研究中將本實(shí)驗(yàn)室分離的BVDV-Ⅰ型毒株SD0803在MDBK細(xì)胞上連續(xù)傳代40代，讓其在細(xì)胞上適應(yīng)性生長(zhǎng)，并對(duì)傳代病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。為確保病毒在細(xì)胞上的連續(xù)傳代，采用套式PCR 檢測(cè)P20、P40細(xì)胞上清中的病毒核酸及IFA方法檢測(cè)P10、P20、P30、P40細(xì)胞中的病毒蛋白，結(jié)果均表明病毒在能細(xì)胞上連續(xù)傳代。

根據(jù)能否引起細(xì)胞病變，可將BVDV 分為2種生物型：致細(xì)胞病變型（cytopathic CP）和非致細(xì)胞病變型（non-cytopathic, NCP），當(dāng)NS2～3區(qū)域有外源序列的插入，基因重組、重排或缺失時(shí)，NCP型BVDV會(huì)轉(zhuǎn)化為CP型BVDV[17,18]。本研究中將病毒連續(xù)傳到40代時(shí)測(cè)序表明，雖然病毒既無(wú)外源序列插入，也無(wú)基因重組、重排或缺失，細(xì)胞形態(tài)觀察也一致證明病毒未從NCP型轉(zhuǎn)為CP型，但與親代病毒相比，核苷酸的同源性為99.8%，氨基酸的同源性為99.6%，說(shuō)明病毒在傳代過(guò)程其基因組有變異。病毒的生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，病毒在培養(yǎng)48 h達(dá)到復(fù)制高峰，48 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，親本和傳代病毒均能在細(xì)胞中獲得較高的病毒復(fù)制效率。病毒在傳代過(guò)程中，病毒的基因組發(fā)生了一定的遺傳變異，但是這些遺傳變化并不能導(dǎo)致病毒在細(xì)胞上獲得較高的病毒復(fù)制效率。病毒在細(xì)胞中的生長(zhǎng)特性未變化，由此，我們獲得的細(xì)胞適應(yīng)毒株為研制豬源BVDV疫苗候選株奠定了物質(zhì)儲(chǔ)備，為下一步研究其致病性和抗原性奠定基礎(chǔ)。

表2 SD0803 P40與親代病毒核苷酸與氨基酸同源性比較Table 2 Nucleotide and amino acid homology between SD0803 P40 and parental virus

表3 SD0803 P40與親代病毒ORF編碼區(qū)氨基酸序列比較Table 3 Amino acid sequence comparison of ORF coding region between SD0803 P40 and parental virus

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