劉閏夏, 藺 濤,2, 田德斌,韋祖樟, 孫利廠,2, 陸嘉琦, 袁世山, 童光志

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病 毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的豬的一種高度接觸性傳染病，主要引起母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重危害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。PRRSV與馬動(dòng)脈炎病毒、小鼠乳酸脫氫酶病毒和猴出血熱病毒同屬于動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬[3-5]。根據(jù)血清型和遺傳特性的差異，PRRSV分為兩個(gè)基因型，即歐洲（I）型和美洲（II）型，兩型同源率約為60%[6-9]。

目前已知PRRSV基因組有10個(gè)首尾重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中ORF1a和ORF1b編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5編碼囊膜蛋白，ORF6和ORF7分別編碼膜基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N，ORF5a是最新發(fā)現(xiàn)的普遍存在于動(dòng)脈炎病毒中的ORF，它編碼5a蛋白[10,11]。ORF5a大部分序列與ORF5重疊甚至完全包埋在ORF5中，它們可能由同一個(gè)亞基因組sg mRNA5轉(zhuǎn)錄，但使用不同的讀碼框[12]。目前人們對(duì)5a蛋白了解甚少，深入研究5a蛋白的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)于全面認(rèn)識(shí)PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白及其相互作用具有重要意義。但是ORF5a絕大部分序列與ORF5重疊，我們只有在保證不改變ORF5氨基酸編碼序列的前提下，通過突變ORF5a的個(gè)別核苷酸來改變5a蛋白的氨基酸序列進(jìn)而研究5a蛋白的功能，這使得研究內(nèi)容非常有限。

本研究利用PRRSV反向遺傳系統(tǒng)[13]，將I型PRRSV的ORF2～ORF5a替換進(jìn)II型PRRSV的相應(yīng)區(qū)域，目的是探討I型5a蛋白及其編碼基因能否在II型PRRSV中發(fā)揮作用，同時(shí)期望將I型PRRSV的ORF5a從ORF5中獨(dú)立出來，從而為進(jìn)一下研究5a蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 倉鼠腎傳代細(xì)胞BHK-21購自美國ATCC；非洲綠猿猴腎細(xì)胞（MARC-145）細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；基因I型PRRSV全長感染性克隆pSHE（GenBank登錄號(hào)：GQ461593），基因II型PRRSV全長感染性克隆pAPRRS(GenBank登錄號(hào)為GQ330474)均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[14]；pAPRRSasc是在pAPRRS的ORF1b與ORF2之間插入AscI位點(diǎn)的全長感染性克隆，由田德斌博士構(gòu)建[15]。

1.1.2 主要試劑 SOE-PCR用聚合酶pfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase購自Stratagene公司；T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司；病毒上清RNA抽提試劑盒QIAgen Viral RNA Mini Kit購于QIAGEN公司；化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑”LTX and PLUS”和細(xì)胞總RNA提取試劑TRIZOL?reagent購自Invitrogen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司；免疫熒光試驗(yàn)所用北美型PRRSV 抗N蛋白單克隆抗體由南達(dá)科他州立大學(xué)（South Dakota State University）方英博士惠贈(zèng)；針對(duì)5a蛋白的多克隆抗體由北京康為世紀(jì)物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照vARRS和vSHE病毒基因組序列，利用OLIGO軟件設(shè)計(jì)（表1）。

1.2.2 全長嵌合克隆的構(gòu)建 pAPRRS-SHE2345a是通過SOE-PCR將pSHE的ORF2～ORF5a替換進(jìn)pAPRRS的相應(yīng)區(qū)域。以pSHE為模板，利用上游引物FS234asc（含AscI位點(diǎn)）和下游引物RS5a-A5擴(kuò)增pSHE的ORF2～ORF5a序列S2345a，同時(shí)以pAPRRS為模板，利用上游引物FS5a-A5和下游引物RA14780擴(kuò)增pAPRRS的ORF6序列A6，然后以回收純化的DNA片段S2345a和A6為模板，上游引物FS234asc和下游引物RA14780擴(kuò)增雜和片段S2345a-A6。用AscI和XbaI雙酶切雜和片段S2345a-A6和全長克隆pAPRRSasc，回收目的片段，由T4 DNA連接酶連接獲得全長嵌合質(zhì)粒pAPRRS-SHE2345a。另外，在pAPRRS-SHE2345a的基礎(chǔ)上引入pAPRRS TRS5，同時(shí)分別保留和突變pAPRRS ORF5a的起始密碼子，構(gòu)建兩個(gè)嵌合質(zhì)粒pAPRRSSHE2345aT1 和 pAPRRS-SHE2345aT2(圖 1)， 構(gòu)建方法同上。構(gòu)建的全長質(zhì)粒都通過測序和SmaI酶切鑒定。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取，并于轉(zhuǎn)染前測定質(zhì)粒濃度。待BHK-21細(xì)胞長滿單層約80%左右，用LTX &PLUS reagent轉(zhuǎn)染3 μg質(zhì)粒，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收上清感染MARC-145細(xì)胞。每天觀察細(xì)胞，待細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）達(dá)80%時(shí)收取細(xì)胞上清標(biāo)記為第1代（P1），連續(xù)傳代至P5代；若未產(chǎn)生CPE，則在傳到MARC-145細(xì)胞d6收取上清，繼續(xù)盲傳3代以確定其感染性。

1.2.4 病毒RNA提取及RT-PCR檢測 對(duì)于產(chǎn)生CPE的感染性克隆，用QIAampViral RNA試劑盒提取P5代病毒RNA。 以提取的RNA為模板，RA14780為引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后以cDNA為模板，F(xiàn)A12066/RA14780為擴(kuò)增引物，用pfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及純化后，送上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

表1 構(gòu)建嵌合cDNA克隆所需引物Table 1 Primers used for construction of full-length cDNA clones

圖1 嵌合克隆構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of chimeric cDNA clones

1.2.5 嵌合病毒亞基因組的檢測 轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞24 h后，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，AMV反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，SF12/SR14365為上下游引物擴(kuò)增sg mRNA5。PCR產(chǎn)物純化后連接目的片段至pGEM-T載體，22 ℃快速連接10 min，挑取10個(gè)白斑送上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect fluorescence assay,IFA） 轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞24 h時(shí)，用冰甲醇固定細(xì)胞10 min，然后以1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 室 溫 封 閉 30 min； 加 入PRRSV N蛋白的特異性單抗，37 ℃孵育2 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞5次；加入lexa Fluor?568羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗5次后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.7 嵌合病毒的多步生長曲線 以0.01 MOI（multiplicity of infection）P3代病毒感染MARC-145細(xì)胞，分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)（12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h） 收 集 病毒上清200 μL， 同時(shí)補(bǔ)充200 μL含2%FBS的MEM。測定各時(shí)間段病毒的滴度，并用GraphPad軟件繪制病毒的多步生長曲線。

1.2.8 嵌合病毒的空斑形態(tài)學(xué)分析 將P3代病毒500 μL/孔感染6孔板中的MARC-145細(xì)胞，37 ℃孵育1 h。加入等比例的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×MEM（含2%FBS），5 mL/孔鋪到細(xì)胞板中，室溫凝固后于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～5 d。待出現(xiàn)空斑后，加入4%的甲醛溶液固定細(xì)胞1 h，去除凝膠并用5%結(jié)晶紫染色即可觀察空斑形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 嵌合感染性克隆的構(gòu)建及鑒定 在歐洲型pSHE和北美型pAPRRS兩個(gè)全長感染性克隆的基礎(chǔ)上，通過SOE-PCR的手段將歐洲型的ORF2～ORF5a替換入北美型PRRSV骨架中，成功構(gòu)建了3個(gè)嵌合克隆。pAPRRS-SHE2345a屬于ORF2～ORF5a的完全替換，目的是使pSHE的ORF5a及pAPRRS的ORF5利用pSHE的TRS5完成轉(zhuǎn)錄。pAPRRS-SHE2345aT1是在pAPRRSSHE2345a的ORF5起始密碼子之前加入pAPRRSORF5起始密碼子之前的58個(gè)堿基（包括pAPRRS TRS5及ORF5a的起始密碼子），目的是使嵌合克隆利用pAPRRS TRS5完成ORF5的轉(zhuǎn)錄，但同時(shí)引入了pAPRRS的ORF5a，即有兩個(gè)完整的ORF5a（分別屬于pSHE和pAPRRS）同時(shí)存在于pAPRRS-SHE2345aT1。為使嵌合克隆只表達(dá)pSHE的5a蛋白，我們突變pAPRRS的ORF5a的起始密碼子構(gòu)建了第三個(gè)嵌合克隆pAPRRSSHE2345aT。所有全長克隆均經(jīng)SmaI酶切鑒定，與親本質(zhì)粒pAPRRS切出的條帶完全相同（圖2）。

圖2 全長克隆Sma I酶切圖譜Fig.2 Identify the full-length cDNA clones by Sma I digestion

2.2 嵌合對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的影響 所有嵌合克隆轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞24 h后，進(jìn)行免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)5a、GP5和N蛋白的翻譯情況。如圖3所示，嵌合克隆都能檢測到5a蛋白和N蛋白的表達(dá)。vAPRRS-SHE2345aT1 和vAPRRS-SHE2345aT2能檢測到GP5的表達(dá)，但vAPRRS-SHE2345a沒有檢測到GP5表達(dá)，可能是由于GP5表達(dá)的翻譯起始信號(hào)存在于ORF5起始密碼子之前的序列中，而在構(gòu)建時(shí)并沒有將這些序列嵌合到pAPRRSSHE2345a中，從而影響了GP5蛋白的翻譯。

圖3 結(jié)構(gòu)蛋白的間接免疫熒光分析Fig.3 Detection of the expression of structure proteins by indirect fl uorescence assay

2.3 子代病毒的拯救及嵌合序列的穩(wěn)定性 為了驗(yàn)證嵌合克隆對(duì)病毒感染性的影響，用BHK-21的轉(zhuǎn)染上清感染Marc-145細(xì)胞，vAPRRSSHE2345aT1和vAPRRS-SHE2345aT2都能拯救感染性的到病毒粒子，而pAPRRS-SHE2345a由于不能表達(dá)GP5而沒有得到拯救病毒。將vAPRRSSHE2345aT1和vAPRRS-SHE2345aT2在Marc-145細(xì)胞上傳至P5代，提取病毒RNA，用RTPCR方法對(duì)嵌合病毒的結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域（ORF2a-ORF6）進(jìn)行擴(kuò)增測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該段嵌合序列在核苷酸水平上沒有發(fā)生任何突變，表明I型PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白序列能夠穩(wěn)定存在于II型PRRSV基因組中，而且vAPRRS-SHE2345aT2能夠利用獨(dú)立存在的pSHE ORF5a序列成功表達(dá)5a蛋白。

2.4 嵌合克隆亞基因組的檢測 轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞總RNA，能夠檢測到嵌合克隆的sg mRNA5及sg mRNA7（圖4），說明嵌合克隆不影響病毒亞基因組的轉(zhuǎn)錄。由于嵌合克隆的sg mRNA5都是由pAPRRS和pSHE的部分序列嵌合而成，所以形成的條帶都大于vAPRRS的sg mRNA5。

圖4 RT-PCR方法檢測ORF5及ORF7的轉(zhuǎn)錄Fig.4 Detection of sg mRNA5 and sg mRNA7 by RT-PCR

2.5 拯救病毒的多步生長曲線 通過繪制病毒的多步生長曲線(圖5)，結(jié)果顯示嵌合病毒vAPRRSSHE2345aT1達(dá)到高峰的時(shí)間為感染后60 h，而骨架親本病毒vAPRRS、供體親本病毒vSHE及嵌合病毒vAPRRS-SHE2345aT2達(dá)到高峰的時(shí)間均為感染后72 h，比較生長曲線發(fā)現(xiàn)嵌合病毒與親本病毒具有相似的增殖能力。

圖5 病毒的多步生長曲線Fig.5 Virual multi-step growth curve

2.6 嵌合病毒的空斑形態(tài)學(xué)分析 將嵌合病毒vAPRRS-SHE2345aT1、 vAPRRS-SHE2345aT2和親本病毒vAPRRS、vSHE的P3代病毒進(jìn)行空斑形態(tài)分析（圖6），結(jié)果表明嵌合病毒與親本病毒空斑的大小及形態(tài)并無明顯區(qū)別，說明嵌合病毒在MARC-145中的增殖及擴(kuò)散能力與親本病毒相似。

3 討論

5a蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的在動(dòng)脈炎病毒中普遍存在的第8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，通過對(duì)ORF5a的基因序列分析發(fā)現(xiàn)，ORF5a絕大部分甚至全部與ORF5重疊，而且采用不同的讀碼框，這對(duì)我們研究5a蛋白的結(jié)構(gòu)與功能帶來極大的困難。孫利廠等就是通過突變單個(gè)堿基證明了5a蛋白的存在是PRRSV復(fù)制所必需的，同時(shí)證明了5a蛋白的適當(dāng)延長不影響病毒的感染性（未發(fā)表）。如果我們將ORF5a從ORF5序列中獨(dú)立出來，就能在不破壞GP5編碼序列的前提下單獨(dú)研究5a蛋白的功能，從而為進(jìn)一步研究動(dòng)脈炎病毒的蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供一定的理論基礎(chǔ)。田德斌等[15]將歐洲型PRRSV的ORF2-5a序列成功替換入北美型pAPRRS的相應(yīng)區(qū)域，得到拯救病毒并且嵌合序列能夠穩(wěn)定存在于嵌合病毒中，這給本研究感染性克隆的構(gòu)建提供了材料和方法。

本研究利用反向遺傳技術(shù)，將歐洲型感染性克隆pSHE的ORF2-5a替換入北美型感染性克隆pAPRRS的相應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建了全長嵌合克隆pAPRRS-SHE2345a， 使pSHE的ORF5a獨(dú) 立 存在，但是沒有得到拯救病毒。通過對(duì)其亞基因組及免疫熒光檢測分析，骨架vAPRRSORF5利用pSHE的TRS5完成轉(zhuǎn)錄得到完成的嵌合sg mRNA5，但可能由于vAPRRSORF5起始密碼子前與GP5表達(dá)相關(guān)的翻譯起始序列沒有被嵌合入pAPRRSSHE2345a，導(dǎo)致pAPRRS-SHE2345a的GP5蛋白沒有翻譯，因此未拯救到有感染性的病毒粒子。因此我們又構(gòu)建了pAPRRS-SHE2345aT1，引入了pAPRRSORF5起始密碼子前的58個(gè)核苷酸（包括pAPRRS TRS5及其側(cè)翼序列、ORF5a的起始密碼子）以確保vAPRRS的GP5表達(dá)。由于pAPRRSSHE2345aT1中有兩個(gè)完整的ORF5a（分別屬于pSHE和pAPRRS）同時(shí)存在，所以該嵌合病毒可能同時(shí)表達(dá)vSHE和vAPRRS的5a蛋白。通過多步生長曲線可以看出，vAPRRS-SHE2345aT1達(dá)到最高滴度的時(shí)間比兩個(gè)親本病毒早12 h，而且最高滴度高于親本病毒的最高滴度，暗示5a蛋白影響病毒的復(fù)制效率。構(gòu)建了pAPRRS-SHE2345aT2突變pAPRRS的ORF5a的起始密碼子，以確保只有拉開的pSHE的ORF5a表達(dá)的5a蛋白在嵌合病毒中發(fā)揮作用。

圖6 空斑形態(tài)學(xué)比較Fig.6 Viral plaque morphology assay

總之vAPRRS-SHE2345a的拯救失敗及vAPRRS-SHE2345aT1、 vAPRRS-SHE2345aT2 的拯救成功說明了病毒ORF前存在與亞基因組轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯相關(guān)的作用元件，但具體是哪部分序列還需要下一步實(shí)驗(yàn)證明。vAPRRS-SHE2345aT2成功將ORF5a拉開，證明了PRRSVORF5a是可以獨(dú)立于ORF5存在的，為進(jìn)一步研究5a蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] Tian K, Yu X, Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PloS One, 2007, 2(6): e526.

[2] Li Y, Wang X, Bo K,et al.Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastern region of China[J].Vet J, 2007,174(3): 577-584.

[3] Snijder E J, Meulenberg J J.The molecular biology of arteriviruses[J].J Gen Virol, 1998, 79(5): 961-979.

[4] Gorbalenva A E, Enjuanes L, Ziebuhr J,et al.Nidovirales:evolving the largest RNA virus genome[J].Virus Res,2006, 117(1): 17-37.

[5] Wensvoort G, Terpstra C, Pol J M,et al.Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus[J].Vet Q, 1991, 13(3): 121-130.

[6] Wensvoort G, de Kluwer E P, Pol J M,et a1.Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of raystery swine disease research at Letystad [J].Vet Micro, 1992(33): 185-193.

[7] Benfield D A, Nelson E, Collins J E,et a1.Characterization of swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)virus(isolate ATCC VR-2332)[J].J Vet Diagn Invest, 1992(4)：127-133.

[8] Meng X J, Paul P S, Halbur P G,et al.Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A.and Europe[J].Arch Virol, 1995,140(4): 745-755.

[9] Nelson E A, Christopher-Hennings J, Drew T,et al.Differentiation of U.S.and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies[J].J Clin Microbiol, 1993, 31(12): 3184-3189.

[10] Conzelmann K K, Visser N, Van Woensel P,et al.Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group[J].Virology, 1993, 193(1): 329-339.

[11] Johnson C R, Griggs T F, Gnanandarajah J,et al.Novel structural protein in porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded in an alternative open reading frame 5 present in all arteriviruses[J].J Gen Virol, 2011,92(5): 1107-1116.

[12] Firth A E, Zevenhoven-Dobbe J C, Wills N M,et al.Discovery of a small arterivirus gene that overlaps the GP5 coding sequence and is important for virus production[J].J Gen Virol, 2011, 92(5): 1097-1106.

[13] Lv J, Zhuang J, Sun Z,et al.An infectious cDNA clone of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus variant associated with porcine high fever syndrome[J].J Gen Virol, 2008, 89(Pt9): 2075-2079.

[14] 袁世山, 韋祖樟.PRRSV全長感染性cDNA克隆的構(gòu)建: 非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白之間編碼區(qū)的分離[J].中國科學(xué)C輯: 生命科學(xué), 2008, 38: 66-73.

[15] Tian D, Zheng H, Zhang R,et al.Chimeric porcine reproductive and respiratory syndrome viruses reveal full function of genotype 1 envelope proteins in the backbone of genotype 2[J].Virology, 2011, 412(1): 1-8.