許運斌，徐潔萍，張金陽，昝 潔，阮系真, 周繼勇,2

（1.浙江大學 農(nóng)業(yè)部動物病毒學重點實驗室，杭州 310029；2.浙江大學 傳染病診治國家重點實驗室，杭州 310003）

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一種能夠?qū)е聨缀跛袦匮獎游镏滤佬阅X炎的人獸共患傳染病，死亡率幾乎達到100%。在亞非拉等發(fā)展中國家，狂犬病一直是困擾當?shù)厝祟惻c動物健康的重要公共衛(wèi)生問題，據(jù)WHO統(tǒng)計全世界每年5.5萬人死于狂犬病[1]。中國是狂犬病的高發(fā)地區(qū)，人的狂犬病病死數(shù)位居世界第二，僅次于印度。據(jù)國家疾病控制中心發(fā)布的疫情報告，自2002年以來每年因該病死亡的人數(shù)均超過2000人，并且逐年上升，在2007年達到高峰期，年死亡人數(shù)達3302人?？袢∈钱斍皣乐匚：χ袊残l(wèi)生的重大疫病[2]。

狂犬病病毒（Rabies virus，RV）是彈狀病毒科（Rhabdoviridae）、狂犬病病毒屬（Lyssavirusgenus）的成員，為不分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，基因組長度為11 928～11 932 nt，由5種結(jié)構(gòu)基因組成，從基因組的3'端到5'端分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA聚合酶（L）5種結(jié)構(gòu)蛋白。其中P蛋白是一種高度親水性蛋白，與N蛋白和L蛋白一起負責病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復制[3]。

作為RV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，21世紀以來研究人員對P蛋白的功能研究已取得相當?shù)某煽儭?000年Raux等[4]和Jacob等[5]發(fā)現(xiàn)了RV P蛋白與動力蛋白輕鏈亞基LC8的相互作用，認為這種相互作用可能在RV軸突逆向軸漿運輸中發(fā)揮著重要的作用。但Tan等[6]研究表明缺失LC8結(jié)合基序的RV重組病毒依然可侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，只不過RV在神經(jīng)細胞中的復制和轉(zhuǎn)錄稍微有所減弱。2002年Blondel等[7]進一步發(fā)現(xiàn)P蛋白與干擾素誘導蛋白PML之間的相互作用。2005年Vidy等[8]和2006年Brozozka等[9]研究表明P蛋白可與激活的STAT1和STAT2結(jié)合，阻斷其入核轉(zhuǎn)運并且抑制干擾素信號轉(zhuǎn)導通路，最終抑制感染細胞的抗病毒反應。

盡管如此，關(guān)于P蛋白的研究還是相對比較局限。本研究通過Bac-To-Bac桿狀病毒系統(tǒng)首次成功表達了RV的P蛋白，不僅為蛋白多抗或單抗的制備篩選、蛋白結(jié)構(gòu)的解析以及蛋白功能的全面研究奠定基礎(chǔ)，而且為狂犬病酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immuno-soebent assay, ELISA） 抗體診斷試劑盒的開發(fā)提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌種、細胞和載體 RV ERA毒株、E.coliDH10Bac、TOP10感受態(tài)細胞、昆蟲細胞系Sf9由浙江大學農(nóng)業(yè)部動物病毒學重點實驗室保存；桿狀病毒表達載體pFastBacHTA購自Invitrogen公司。

1.2 工具酶及試劑Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、蛋白質(zhì)和DNA分子量標準物購自TaKaRa公司；小量DNA膠回收試劑盒購自AxyGen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為MBI公司；FITC標記羊抗鼠IgG購自KPL公司；鼠抗磷蛋白單克隆抗體7B3由本實驗室制備；Ni-NTA瓊脂糖凝膠鎳柱購自QIAGEN公司。

1.3 引物 根據(jù)GenBank登錄的RV ERA株磷蛋白基因序列（EF206707），設計合成擴增RV磷蛋白基因的特異性引物，RV-P-F-Prim：5'-GCCGAAT TCATGAGCAAGATCTTTGTC-3'（上游）；RVP-R-Prim：5'- GACGTCGACTTAGCAAGATGTA TAGCG -3'（下游）。上下游引物的5'端分別引入EcoR I和SalI酶切位點。M13通用引物序列參照英駿公司Bac-To-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊設計。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 從感染ERA株RV的細胞中抽提病毒的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用設計的特異性引物對磷蛋白基因進行PCR擴增，PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 15 s、60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸70 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物和pFastBacHTA轉(zhuǎn)移載體經(jīng)EcoR I和SalI雙酶切后分別回收，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)雙酶切及特異性引物PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒（pFastBacHTA-P）送上海英駿公司測序鑒定。將序列正確的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA-P轉(zhuǎn)化到E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞中，經(jīng)過藍白斑篩選和PCR鑒定重組轉(zhuǎn)座子rBacmid-P。

1.5 重組桿狀病毒制備 將重組轉(zhuǎn)座子rBacmid-P在Cellfectin II Reagent介導下以5:6的比例轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的Sf9細胞，27℃無CO2培養(yǎng)72 h，待細胞發(fā)生明顯病變后收集細胞上清為P0代病毒毒液，經(jīng)3次傳代后得到含有磷蛋白基因的重組桿狀病毒為毒種液。

1.6 重組蛋白的純化 用PBS重懸并收集病變細胞，94×g離心10 min，沉淀溶解在含有10 mmol/L imidazole的lysis buffer中，反復凍融3次后，4℃下通過超聲裂解細胞（頻率為0.4～0.6 kW，工作時間2 s，間歇2 s，全程時間90 s，重復2次），13 523×g離心30 min，取上清，按照QIAGEN公司His融合蛋白純化試劑盒說明書步驟天然條件下純化可溶蛋白。

1.7 表達蛋白的鑒定

1.7.1 間接免疫熒光（indirect immunofluoreseent assay，IFA）檢測表達的RV磷蛋白 用重組病毒rBacmid-P感染Sf9細胞，72 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，以固定液（4%甲醛）于常溫下固定細胞約20 min，晾干，同時以未感染病毒毒液的正常Sf9細胞作陰性對照。以鼠抗狂犬病病毒磷蛋白單克隆抗體7B3（1:800）作為一抗于37℃孵育1.5 h，PBS洗滌3～5次，再用FITC標記的羊抗鼠（1:400）于37℃孵育1 h，PBS洗滌3～5次，熒光顯微鏡下觀察熒光反應。

1.7.2 重組蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析將重組病毒rBacmid-P感染Sf9細胞，當細胞出現(xiàn)明顯病變時，按照1.6的方法進行重組蛋白的純化，然后對其進行SDS-PAGE和Western blot分析，同時以野生型病毒感染的細胞作為陰性對照。

2 結(jié)果

圖1 pFastBacHTA-P的雙酶切鑒定（A）和rBacmid-P的PCR鑒定（B）Fig.1 Identif i cation of pFastBacHTA-P and rBacmid-P by restriction enzymedigestions（A） and PCR（B）

2.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 采用RT-PCR技術(shù)，用特異性引物RV-P-F/R-Prim從感染細胞總RNA中擴增出約900 bp大小的磷蛋白基因cDNA片段。將PCR產(chǎn)物和轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA經(jīng)EcoR I和SalI雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10，經(jīng)雙酶切鑒定pFastBacHTA-P重組質(zhì)粒，插入的磷蛋白基因與預期大小符合（圖1A）。以rBacmid-P為模板，用M13通用引物進行PCR鑒定，擴展出約3300 bp的片段，表明磷蛋白基因已經(jīng)轉(zhuǎn)座成功（圖1B），而未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bacmid片段大小為300 bp。

2.2 重組病毒的包裝 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體rBacmid-P的DNA在Cellfectin介導下以5:6的比例轉(zhuǎn)染入Sf9細胞，在轉(zhuǎn)染后48 h可觀察到轉(zhuǎn)染的細胞出現(xiàn)生長停止，直徑變大，細胞形態(tài)大小不一等病變，隨著時間的延長，到轉(zhuǎn)染后96 h，細胞出現(xiàn)較大范圍的脫落。而正常細胞則細胞直徑較小，且細胞大小較為均勻（圖2），表明重組桿狀病毒包裝成功。

2.3 SDS-PAGE與Western blot分析磷蛋白的表達Sf9細胞接種重組病毒后，首先進行重組蛋白的純化，然后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在約42 kDa處有明顯條帶，病毒感染72 h后細胞病變明顯，在接毒后72～96 h蛋白表達量最高。用抗His標簽的單克隆抗體作為一抗進行Western blot分析，結(jié)果出現(xiàn)與預期分子量大小相符的特異性條帶，同時利用正常未感染重組病毒額細胞作為陰性對照，其相應位置沒有條帶出現(xiàn)，表明RV磷蛋白在昆蟲細胞內(nèi)獲得表達（圖3）。

圖2 重組桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染前后Sf9細胞的形態(tài)圖（200×）Fig.2 Morphological changes of Sf9 cells infected with baculovirus（200×）

圖3 Western blot（B）和SDS-PAGE（A）分析狂犬病病毒磷蛋白在昆蟲細胞中的表達Fig.3 Western blot analysis（B）and SDS-PAGE（A）of the expression of phosphoprotein in Sf9 cells

2.4 Sf9細胞表達蛋白的IFA檢測 利用鼠抗磷蛋白的單克隆抗體7B3通過IFA對重組病毒感染的昆蟲細胞進行檢測。結(jié)果表明（見圖4），重組桿狀病毒感染的Sf9細胞可以與鼠抗狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體發(fā)生反應，產(chǎn)生特異性的亮綠色熒光，而未感染重組桿狀病毒的細胞則呈陰性反應，未出現(xiàn)熒光，表明RV磷蛋白在昆蟲細胞內(nèi)獲得表達。

圖4 IFA分析RV磷蛋白的表達（200×）Fig.4 Detection of rabies virus phosphoprotein expression by IFA（200×）

3 討論

本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)在大腸桿菌中構(gòu)建含有RV P基因的重組桿狀病毒基因組，拯救出具有復制能力的重組桿狀病毒，重組桿狀病毒感染Sf9細胞后，用Western blot檢測到相對分子量約為42 kDa狂犬病毒P蛋白，首次實現(xiàn)了狂犬病毒P蛋白在昆蟲細胞中的表達。由于使用的pFastBacHTB載體提供的起始密碼子能使基因高效表達，且由多聚組氨酸標記的表達產(chǎn)物可被金屬親和樹脂快速純化，我們利用親和層析的方法進一步得到了高純度的重組P蛋白。由此，證明本試驗已建立了狂犬病毒P蛋白的真核表達系統(tǒng)。

就不同的基因工程表達系統(tǒng)而言，原核表達系統(tǒng)具有成本低廉、操作簡單、生產(chǎn)周期短、表達量高、表達蛋白易于純化等優(yōu)點，得到了廣大科研工作者的青睞。本實驗室2007年在大腸桿菌中實現(xiàn)了RV核蛋白的高效表達[10]，但該系統(tǒng)表達的蛋白缺少翻譯后修飾加工，這使得表達的蛋白與天然蛋白存在抗原性差異。酵母蛋白表達系統(tǒng)具有表達量高、糖基化機制接近高等真核生物、分泌蛋白易純化、易實現(xiàn)高密發(fā)酵等優(yōu)點，也不斷地得到應用。但Klepfer等[11]研究表明，在酵母中表達的RV糖蛋白在糖基化類型和位點上與天然蛋白存在差異，由此影響其免疫原性，而且表達蛋白產(chǎn)物易降解，表達量不可控。2007年Zhang等[12]在腺病毒中表達了G蛋白，但這種病毒載體存在潛在的安全性問題。真核表達Bac-To-Bac桿狀病毒系統(tǒng)是一種利用桿狀病毒作為載體，在昆蟲培養(yǎng)細胞或蟲體中表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)，具有同多數(shù)高等真核生物相似的轉(zhuǎn)譯蛋白的能力以及翻譯后修飾、加工的過程，表達的蛋白一般具有可溶性，且抗原性和生物學功能非常接近天然的病毒蛋白，具有良好的生物學活性、安全性，表達水平高[13,14]。目前為止，已有成千上萬的蛋白應用該系統(tǒng)得到了有效的表達，國內(nèi)外采用該系統(tǒng)表達RV G蛋白、N蛋白已有相關(guān)的報道[15-17]，本試驗利用該系統(tǒng)成功表達了狂犬病毒P蛋白，該重組蛋白能與抗狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性反應，表明P蛋白在昆蟲細胞內(nèi)發(fā)生了正確的折疊，具有良好的反應性。這種與單克隆抗體具有良好免疫反應性P蛋白體系的建立為進一步的狂犬病病毒P蛋白結(jié)構(gòu)的解析，以及狂犬病ELISA抗體診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

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