王雪芳，劉艷明

(1.河北北方學(xué)院生理教研室，河北 張家口 075061;2.中國人民解放軍251醫(yī)院心二內(nèi)科，河北 張家口 075000)

近年來，隨著導(dǎo)管消融及起搏器植入技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床醫(yī)師發(fā)現(xiàn)一些心臟疾病如室性早搏、室性心動過速、心室撲動等惡性心律失常是導(dǎo)致心臟性猝死(sudden cardiac death SCD)的主要原因，并且這些心律失常的發(fā)生常與心室流出道組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及生理功能異常相偶聯(lián)。我教研室早期研究證明，左心室流出道不僅僅是心臟血液的流經(jīng)通路，其電生理特性表現(xiàn)為具有明顯的自律性電活動，是一個潛在的起搏部位，這一部位也受到交感和副交感神經(jīng)的雙重支配，交感神經(jīng)末梢釋放 CA類物質(zhì)。大多數(shù)室性心律失常的藥物治療前景并不樂觀，臨床研究表明，除β受體阻滯劑外，其他抗心律失常的藥物均不能降低死亡率，也不能用于SCD的一級預(yù)防用藥。研究表明，中藥苦參是豆科槐屬植物苦參的干燥根，其對多種原因?qū)е碌男穆墒С＞辛己玫姆乐涡Ч?，但其作用機制尚不明確。本實驗應(yīng)用常規(guī)細胞內(nèi)玻璃微電極記錄手段，觀察苦參的主要有效成分苦參堿對兒茶酚胺類物質(zhì)(E、NE、Iso)誘發(fā)豚鼠心律失常的電生理作用，對進一步尋找高效低毒中藥治療心律失常，體現(xiàn)中藥治療優(yōu)勢具有非常重要的臨床意義和實用價值。

1 材料

1.1 試劑與藥品

配制好的K-H灌流溶液(NaCl 0.12mol/L，KCl 0.47 × 10－2mol/L，CaCl20.25 × 10－2mol/L，MgCl20.12 × 10－2mol/L，NaHCO30.18 × 10－2mol/L，KH2PO40.12×10－2mol/L，葡萄糖 0.8 ×10－2mol/L，pH7.3～7.4)限當(dāng)天使用。實驗藥物苦參堿購于北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司(批準文號國藥準字H20030734)。

1.2 動物

選用0.3kg～0.6kg適齡豚鼠，雌雄不拘，實驗動物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所提供。

1.3 主要儀器

RM-6280C型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)、電刺激器(SEM-7203，日本光電)、微電極放大器(MEZ-8300，日本光電)、隔離器(SS-202J，日本光電)和記憶示波器(VC-11，日本光電)。

2 方法

2.1 動物標本

速擊豚鼠顱致昏，開胸速取心臟，主動脈勻速沖洗，從主動脈瓣的后瓣與左瓣之間迅速剖開動脈壁，斜向右下將心室剖開，三瓣膜保留完整，向下切取長約5mm的心肌組織(含左心室流出道)，制成動物標本。制好的流出道標本用鋼針固定于橡膠灌流槽內(nèi)，不過分牽拉標本，用K-H液以15ml/min進行恒速灌流，灌流液中充以純氧，溫度維持在 32℃ ±0.5℃。標本在K-H液中穩(wěn)定20min后開始實驗。

2.2 過程與分組

玻璃微電極內(nèi)充以3mol/L KCL電極液，測得直流電阻為15Ω～20Ω，使微電極穩(wěn)定于左心室流出道同一細胞內(nèi)，記錄動作電位圖形。如能記錄到自發(fā)電位則不進行電刺激，若記錄不到自發(fā)電活動則將刺激電極置于遠離瓣膜一端的心肌組織上，給以2倍于閾強度、波寬2ms、主周期300ms～500ms的方波刺激，刺激時間不等，待到誘發(fā)出穩(wěn)定自發(fā)電位變化，停止電刺激，穩(wěn)定20min進行實驗。由玻璃電極引導(dǎo)出動作電位，經(jīng)MEZ-8300微電極放大器放大，一條線路輸送到 VC-11記憶示波器進行示波，另一線路經(jīng)RM-6280C多道生理信號采集處理系統(tǒng)輸入計算機觀察，同步記錄分析動作電位各項參數(shù)指標。實驗整體分為正常灌流液組、CA組(E，80μmol/L、NE，80μmol/L、Iso，80μmol/L)和 CA+ 苦參堿(100μmol/L)3組。

2.3 觀測指標

動作電位幅值(amplitude of action potential，APA)，最大舒張電位(maximal diastolic potential，MDP)，4相自動除極速率(velocity of diastolic depolarization，VDD)，0相最大除極速率(maximal rate of depolarization，Vmax)，復(fù)極 50%和 80%時間(50 ﹪ and 80 ﹪ of duration of action potential，APD50and APD80)，自發(fā)放電頻率(rate of pacemaker firing，RPF)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Excel統(tǒng)計軟件進行，動作電位各觀察數(shù)據(jù)均用mean+SE表示，CA組和對照組相比;CA+苦參堿和CA組相比，各項指標采用自身配對t檢驗。

3 結(jié)果

表1 苦參堿對兒茶酚胺致左心室流出道自律細胞電活動影響 (±s，n=12)

表1 苦參堿對兒茶酚胺致左心室流出道自律細胞電活動影響 (±s，n=12)

注:與對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 E 比較:ΔP ＜0.05;與 NE比較:#P＜0.05;與 Iso比較:▲▲P＜0.01

Control組CA 組(80μmol/L) CA+Matrine組(100μmol/L)NE Iso E+M NE+M Iso+M APA(mV) 52.87 ± 7.35 61.28 ± 6.32* 53.66 ± 9.37 76.22 ±11.48＊＊ 60.66 ± 5.12 53.09 ±10.11 66.32 ± 7.65 E▲MDP(mV) －53.61 ± 7.37 －59.21 ± 5.39 －60.38 ± 9.11 －70.97 ± 8.56＊＊ －58.13 ± 6.79 －58.24 ±11.00 －60.37 ±10.22▲VDD(mV/s) 13.79 ± 6.28 28.96 ±11.38* 27.77 ±12.61*33.54 ± 8.28＊＊ 16.28 ±10.67△ 14.38 ± 7.36# 17.38 ± 9.96▲▲Vmax(V/s) 10.64 ± 4.31 18.64 ± 3.23 17.35 ± 9.12 29.16 ± 3.54＊＊ 12.44 ± 5.73 17.59 ± 8.21 13.67 ± 4.84▲▲APD50(ms) 93.12 ±11.10 70.28 ± 9.54* 69.36 ±11.22*58.01 ± 6.44＊＊ 90.65 ± 8.36△ 92.38 ± 6.00# 90.38 ± 4.56▲▲APD80(ms) 153.38 ±32.47 121.35 ± 6.16* 151.33 ±13.26 110.22 ±20.06＊＊ 150.47 ±13.28△ 156.33 ±12.18 152.33 ±19.88▲▲RPF(bmp) 104.22 ± 30.41 158.43 ±20.09＊＊ 143.55 ±30.26*160.74 ±25.39＊＊ 130.39 ± 28.73△ 121.63 ±28.71#110.24 ±26.38▲▲

4 討論

苦參在《本草經(jīng)百種錄》中有這樣的記載:“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦參專治心經(jīng)之火?！笨鄥A是苦參最主要的有效成分，大量動物實驗證實，苦參堿具有調(diào)節(jié)血脂、抗心律失常、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化及增強免疫力等功能［1～3］。苦參堿治療心律失常的研究也越來越成為人們關(guān)注的焦點。近年來發(fā)現(xiàn)，臨床上難以治療的室性早搏、室性心動過速、心室撲動等惡性心律失常與心室流出道的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能異常有關(guān)。目前對心室流出道的生理學(xué)特性也越來為人們所越重視，左心室流出道慢反應(yīng)自律細胞與竇房結(jié)起搏細胞離子流基礎(chǔ)相似，對左心室流出道慢反應(yīng)自律細胞離子流的實驗分析表明，0期除極化離子流主要為Ca2+、少量Na+內(nèi)流，復(fù)極化過程中 K+離子外流起主導(dǎo)作用;4期自動去極化主要由進行性衰減的K+外流和ICa-L參與;在起搏電流中，If電流也起發(fā)揮作用［4］。另研究發(fā)現(xiàn)，左心室流出道慢反應(yīng)自律細胞動作電位呈現(xiàn)多種形態(tài)，即具有一定的電生理異質(zhì)性［5］心肌細胞電生理異質(zhì)性也受多種病理生理因素如缺血缺氧、再灌注損傷、以及藥物等因素的影響，容易出現(xiàn)折返性心律失常，尤其是折返性期前收縮和室性心動過速等心律失常［6，7］。心臟活動受心交感神經(jīng)和心迷走神經(jīng)的緊張性調(diào)節(jié)，心交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放去甲腎上腺素(NE)屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，作用于心肌細胞膜的 β1受體，通過 G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶-cAMP途徑，使細胞內(nèi)cAMP水平升高，激活蛋白激酶A，使細胞內(nèi)很多功能蛋白磷酸化，進而導(dǎo)致心肌細胞的離子流變化，引起心率加快、傳導(dǎo)性增加、心肌收縮力增強效應(yīng)。NE的這種作用與竇房結(jié)4期If離子流的激活加快、Ik的去極化衰減加速，和ICa-L增加，這些離子流的變化引起4期自動去極化速度加快，自律性提高有關(guān)［8］。這種效應(yīng)可被 β受體拮抗劑普萘洛爾或選擇性β1受體拮抗劑阿替洛爾所阻斷。本實驗結(jié)果顯示，用腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、異丙腎上腺素(Iso)這3種兒茶酚胺(CA)類物質(zhì)灌流豚鼠左心室流出道組織后VDD和RPF明顯加快，Iso對左心室流出道自律細胞動作電位的影響強于E、NE，結(jié)果證明了CA可以提高左心室流出道自律細胞的自律性。而這一部位又是臨床心律失常的異位節(jié)律發(fā)生部位之一。實驗中當(dāng)給予苦參堿干預(yù)后發(fā)現(xiàn)20min后動作電位各項指標發(fā)生變化，VDD和RPF明顯減慢，穩(wěn)定20min后動作電位各項指標明顯發(fā)生可逆性變化，VDD和RPF基本恢復(fù)正常，這種作用在 Iso組表現(xiàn)尤為明顯，而 Iso主要作用于心肌細胞膜的β1受體，故推測苦參堿也是通過影響Iso與β1受體的結(jié)合能力來發(fā)揮其作用的。從細胞水平來講，心律失常是心肌動作電位的失常;從分子水平來說，心律失常就是離子流活性的失常。研究發(fā)現(xiàn)，CA可以激活心肌細胞膜上的ICa-L使平臺期Ca2+內(nèi)流增加，內(nèi)流的 Ca2+又激活連接肌質(zhì)網(wǎng)(JSR)上得RyR受體，JSR釋放Ca2+使胞質(zhì)中的Ca2+濃度進一步升高，同時CA降低肌鈣蛋白對Ca2+的親和力，促使 Ca2+與肌鈣蛋白解離，并能促使JSR對Ca2+的回收和心肌細胞膜的Na+-Ca2+交換，加快心肌舒張時胞質(zhì)中 Ca2+的清除，加速心肌的舒張過程［9］。實驗中苦參堿拮抗了這種作用，故認為苦參堿的這種作用可能與其能在平臺期降低Ca2+的濃度，降低心肌細胞的興奮性，延長有效不應(yīng)期，降低異位節(jié)律發(fā)生率有關(guān)。在慢反應(yīng)自律細胞，細胞的興奮性取決于L型Ca2+通道的功能狀態(tài)，而有效不應(yīng)期與鉀離子電流有關(guān)［8，9］?？鄥A拮抗CA導(dǎo)致的左心室流出道慢反應(yīng)自律細胞MDP、APA、Vmax、VDD、RPF 增高，APD50、APD90減慢。故推測苦參堿是通過抑制左心室流出道慢反應(yīng)自律細胞的ICa-L，阻礙了細胞復(fù)極化過程中的Ca2+內(nèi)流，降低了IK，使得動作電位4相自動除極化速度變緩，RPF減慢來實現(xiàn)其作用的。

綜上所述，本實驗的目的是研究苦參堿對兒茶酚胺(CA)誘發(fā)豚鼠左心室流出道自律細胞電生理異常及苦參堿抗心律失常的干預(yù)作用。結(jié)果表明，用苦參堿灌流豚鼠左心室流出道慢反應(yīng)自律細胞可以降低由CA誘發(fā)的RPF升高，可使細胞的興奮性減弱。提示苦參堿對CA導(dǎo)致的左心室流出道慢反應(yīng)自律細胞的異常電生理所致的心律失常有確定作用。同時本實驗也可以為苦參堿藥理機制研究和臨床心律失常中醫(yī)用藥打下基礎(chǔ)。

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