蔡文虹 孫保東 張寶鳳 成文翔 岳野 虎義平 李金超 張鵬

[摘要] 目的 比較體外分離培養(yǎng)成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）的方法。 方法 滑膜組織來自關(guān)節(jié)鏡清洗術(shù)的活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，分別采用消化酶培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)FLS。采用倒置相差顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)對第3～4代FLS進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 2種原代分離培養(yǎng)的方法均可成功培養(yǎng)出FLS。傳代可使FLS達(dá)到形態(tài)學(xué)上的純化要求，倒置相差顯微鏡觀察均符合FLS的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，流式細(xì)胞術(shù)檢測示CD44以及CD90呈強(qiáng)陽性，CD55呈弱陽性。組織塊法培養(yǎng)法FLS成功率較高，細(xì)胞游出時(shí)間較早，細(xì)胞損傷小。 結(jié)論 組織塊培養(yǎng)法適合于FLS的培養(yǎng)，第3～4代細(xì)胞的數(shù)目、活性及純度符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。

[關(guān)鍵詞] 成纖維樣滑膜細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；分離培養(yǎng)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

[中圖分類號(hào)] R-33[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2012）07（c）-0013-03

Comparative of two methods for rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells isolation

CAI Wenhong1 SUN Baodong1 ZHANG Baofeng2 CHENG Wenxiang3 YUE Ye3 HU Yiping3 LI Jinchao3ZHANG Peng3

1.Department of Rheumatology, Shenzhen People′s Hospital in Guangdong Province, Shenzhen 518020, China; 2.Department of Nutrition, Shenzhen People′s Hospital in Guangdong Province, Shenzhen 518020, China; 3.Center for Translational Medicine R&D;, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Science, Guangdong Province, Shenzhen 518055, China

[Abstract] Objective To compare the isolated methods for fibroblast-like synoviocytes (FLS). Methods Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by digestive enzyme culture and tissue culture. The 3～4 generation FLS were identified by morphology and flow cytometry. Results These two methods could culture FLS successfully, tissue culture method was better than the digestive enzyme culture method. FLS showed typical morphological characters under inverted phase contrast microscope. CD44 and CD90 were strong positive, and CD55 was weak positive in the FLS cell surface. Tissue culture method had higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue. Conclusion Tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from synovium tissue. And purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experiments.

[Key words] Fibroblast-like synoviocyte; Cell culture; Separate training; Rheumatoid arthritis

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、炎性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病[1]。該疾病主要侵犯全身各處關(guān)節(jié)，呈多發(fā)性慢性增生性滑膜炎，可破壞關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)囊[2-5]。而其病因至今仍未明確，為明確類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因，發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療方法，滑膜組織為重要的研究對象。

成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-1ike synoviocyte，F(xiàn)LS）是滑膜組織中的重要的組成細(xì)胞，可通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子及免疫反應(yīng)介質(zhì)，是參與RA發(fā)病的重要細(xì)胞[6]。建立FLS體外培養(yǎng)模型對于FLS功能的研究、進(jìn)一步探討RA的發(fā)病機(jī)制及研發(fā)新的RA的藥物具有重要意義[7]。目前用于 FLS體外培養(yǎng)的滑膜多來自關(guān)節(jié)開放性手術(shù)、關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、從滑液中分離等方法[8]。本研究對比經(jīng)典的消化酶培養(yǎng)法與組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行的原代培養(yǎng)，比較獲得體外培養(yǎng)滑膜組織FLS的最佳方法。為之后的其他研究型試驗(yàn)做基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 滑膜組織在患者知情同意的情況下，滑膜組織取自關(guān)節(jié)鏡清洗術(shù)中的活動(dòng)期的RA患者， RA診斷符合1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（Am can College of Rheumatology，ACR）修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、2.5 g/L胰酶EDTA （美國GIBCO公司）；胎牛血清（fetal bovine sell，In，F(xiàn)BS），I型膠原酶、PBS緩沖液、鼠抗人CD44單克隆抗體、鼠抗人CD90單克隆抗體、鼠抗人CD55單克隆抗體（BD Pharmingen公司）。

1.2 方法

1.2.1 消化酶培養(yǎng)法將關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中獲取的滑膜組織采用眼科剪剪碎，加入Ⅰ型膠原酶（1 mg/mL）混勻，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2～4 h；采用100 μm孔徑大小的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾、離心，留取沉淀，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，移入人細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；每2～4天換液一次。

1.2.2 組織塊培養(yǎng)法將關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中獲取的滑膜組織剪成1 mm 大小，而后將組織塊均勻排列在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面。加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液剛剛沒過組織塊表面，先置于培養(yǎng)箱中孵育過夜后，添加一定量的培養(yǎng)液培養(yǎng)；每2～4天換液1次。觀察到組織塊周圍有FLS細(xì)胞爬出，且融合成片后，剔除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察觀察細(xì)胞原代以及傳代后的細(xì)胞形態(tài)以及生長情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況細(xì)胞傳至3～4代時(shí)，將其消化制成1×10⁵/mL的單細(xì)胞懸液，分別加入鼠抗人CD44，CD55，CD90單克隆抗體予以染色，而后采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測這些表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 組織塊培養(yǎng)法與酶消化培養(yǎng)法分別分離培養(yǎng)FLS的比較

組織塊貼壁后，可見FLS從組織塊邊緣游出。經(jīng)過反復(fù)貼壁與傳代后，3～5代滑膜細(xì)胞逐漸純化，主要以成纖維樣細(xì)胞為主，體外生長穩(wěn)定，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)基本為長梭形，少數(shù)為星形、多角形，胞質(zhì)透亮、均勻，核居中，排列有局部方向性。在10例細(xì)胞培養(yǎng)中，酶消化培養(yǎng)法與組織塊培養(yǎng)法各5例，酶消化法成功3次，組織塊培養(yǎng)法成功4次。組織塊培養(yǎng)法比酶消化法（圖1）組織塊貼壁更快，且細(xì)胞生長迅速 （圖2）。

2.2 FLS的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察可見FLS呈三角形，梭形，細(xì)胞核成卵圓形，位于細(xì)胞中央，核仁清晰，細(xì)胞周圍可見分泌物聚集。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，絕大多數(shù)細(xì)胞表面CD44與CD90呈強(qiáng)陽性，CD55在細(xì)胞表面的表達(dá)呈弱陽性（圖3）。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，RA的免疫活動(dòng)主要發(fā)生在滑膜。在活動(dòng)性RA患者中，可見滑膜充血，水腫，大量的免疫細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞也隨之增生，增生的滑膜細(xì)胞具有一定的免疫細(xì)胞的特性，可分泌炎癥因子，加劇RA的進(jìn)展。成纖維樣滑膜細(xì)胞在RA疾病的發(fā)病，進(jìn)展以及疾病的治療中都起著重要的作用[9-10]。鑒于FLS在研究中的重要性， FLS的分離培養(yǎng)成為RA相關(guān)研究的重要組成部分。獲取符合條件的滑膜組織后，獲得均一純化的FLS有較高的技術(shù)要求[11]。

本實(shí)驗(yàn)主要比較了兩種分離培養(yǎng)FLS的方法：組織塊培養(yǎng)法與酶消化法。與酶消化方法相比，組織塊培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)過程中，操作簡單，因?yàn)闊o膠原酶的消化，縮短了分離操作的時(shí)間，同時(shí)避免了蛋白酶對細(xì)胞的損傷，簡便的操作步驟盡可能的減少了污染的機(jī)會(huì)。從而有利于細(xì)胞的貼壁以及生長。FLS 具有可貼壁生長且貼壁能力較強(qiáng)的特性，這一特性有助于去除原代培養(yǎng)中存在的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞以及雜質(zhì)，可通過傳代將其純化。

分離培養(yǎng)后，采用流式細(xì)胞技術(shù)，鑒定了一組細(xì)胞表面的標(biāo)志物CD44，CD55以及CD90。文獻(xiàn)報(bào)道這類表面標(biāo)志物可表達(dá)在成纖維樣細(xì)胞表面?？捎糜趨^(qū)別巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞[12-13]。在的筆者的結(jié)果中CD44與CD55均為強(qiáng)陽性，可認(rèn)為巨噬細(xì)胞、滑膜下層成纖維細(xì)胞的比例極低，即所獲得的細(xì)胞絕大多數(shù)為成纖維樣滑膜細(xì)胞。

筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道均提示，原代培養(yǎng)的FLS，在1～2代純度不夠，超過5代之后，細(xì)胞趨于老化，生長緩慢，7～8代之后完全失去細(xì)胞增殖的活性，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生較大的改變。因此，對于采用原代FLS為研究對象的實(shí)驗(yàn)研究，建議采用第3～4代FLS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Noss EH，Brenner MB. The role and therapeutic implications of fibroblast-like synoviocytes in inflammation and cartilage erosion in rheumatoid arthritis[J]. Immunol Rev，2008，223：252-270.

[2]戴冽，鄭東輝，張白玉. 細(xì)針滑膜活檢術(shù)的臨床應(yīng)用[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2009，13（8）：566-568.

[3]戴冽，莫穎倩，鄭東輝，等. 盲式細(xì)針滑膜活檢及滑膜清除術(shù)的臨床觀察[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2009，13（3）：192-194.

[4]Huber LC，Distler 0，Tamer I，et al. Synovial fibroblasts： key players in rheumatoid arthritis[J]. Rheumatology（Oxford），2006，45（6）：669-675.

[5]Ohki E，Suzuki M，Ape T，et al. Expression of histamine H4 receptor in synovial cells from rheumatoid arthritic patients[J]. Biol Pharm Bull，2007，30（11）：2217-2220.

[6]Brtthl H，Mack M，Niedermeier M，et al. Functional expression of the chemokine receptor CCR7 on fibroblast.1ike synoviocytes[J]. Rheumatology（Oxford），2008，47（12）：1771-1774.

[7]Smith MD，Baeten D，Ulfgren AK，et al. Standardisation of synovial tissue infiltrate analysis：how far have we come? How much further do we need to go[J]. Ann Rheum Dis，2006，65（1）：93-100.

[8]Fan T，Wang D，Zhao J，et al. Establishment and characterization of a novel untransfeeted corneal endothelicell line from New Zealand white rabbits[J]. Mol Vis，2009，15：1070-1078.

[9]蔣建平，朱志剛，易朝輝，等. 人關(guān)節(jié)滑膜A型和B型細(xì)胞的純化分離和體外培養(yǎng)[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2001，26（5）：387-388.

[10]Rosengren S，Boyle DL，F(xiàn)irestein GS. Acquisition，culture，and phenotyping of synovial fibroblasts[J]. Methods Mel Med，2007，135：365-375.

[11]Edwards JC，Leigh RD，Cambridge G. Expression of molecules involved in B lymphocyte survival and diferentiation by synovial fibroblasts[J]. Clin Exp Immunol，1997，108（3）：407-414.

[12]Steenvoorden MM，Tolboom TC，van der Pluijm G，et al. Transition of healthy to diseased synovial tissue in rheumatoid arthritis is associated with gain of mesenchymal/fibrotic characteristics[J]. Arthritis Res Ther，2006，8（6）：R165.

[13]Bartok B，F(xiàn)irestein GS. Fibroblast-like synoviocytes：key effectors cells in rheumatoid arthritis[J]. Immunol Rev，2010，233（1）：233-255.

（收稿日期：2012-06-13本文編輯：林利利）