胡彩虹 游兆彤 朱 康 欒兆雙

(1.浙江大學飼料科學研究所，杭州 310058；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院病毒學與生物技術(shù)研究所，杭州 310021)

仔豬斷奶后受心理、環(huán)境、營養(yǎng)應激等因素的影響，易產(chǎn)生食欲下降、消化不良、腹瀉、生長受阻等，即“仔豬斷奶應激綜合征”，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。在斷奶應激狀態(tài)下仔豬腸形態(tài)和腸黏膜屏障受損是造成“仔豬斷奶應激綜合征”的主要原因之一［1］。鋅是機體必需的微量元素，具有廣泛的生理生化功能，它參與了動物機體300多種酶和功能蛋白的組成［2］。研究發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬飼糧中添加高鋅［含2 000～3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)］能降低腹瀉率，促進生長［3－5］；但是大量未被吸收利用的鋅隨糞便排出體外，造成一定程度的鋅浪費和環(huán)境污染［6－7］。尋找高劑量氧化鋅的替代品一直是微量元素營養(yǎng)研究的熱點之一。納米氧化鋅是納米量級(1～100 nm)的新型鋅源，用量少，在豬、雞上的大量試驗表明其作用效果顯著［8－12］；但尚未見國內(nèi)外文獻報道納米氧化鋅對斷奶仔豬腸黏膜屏障的影響。本試驗旨在研究納米氧化鋅對斷奶仔豬生長性能和腸黏膜屏障的影響，為納米氧化鋅在仔豬生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

氧化鋅(市購，飼料級)；納米氧化鋅由浙江大學飼料科學研究所提供。經(jīng)SPM－9500J3型原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM，日本島津)接觸式掃描模式在大氣環(huán)境下進行成像以及AFM觀察和粒徑分析發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅粒徑為20～80 nm，平均粒徑為65 nm。納米氧化鋅的AFM圖像見圖1。

圖1 納米氧化鋅的AFM圖像Fig.1 AFM image of nano zinc oxide

1.2 試驗動物及飼糧

試驗動物選用“杜×長×大”斷奶仔豬，參照美國NRC(1998)斷奶仔豬的營養(yǎng)需要配合成顆粒料，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗設計與飼養(yǎng)管理

96頭平均體重為(5.7±0.2)kg的21日齡“杜×長×大”斷奶仔豬按胎次一致、體重相近的方法，隨機分成3組:1)對照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧；2)氧化鋅組，飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)的試驗飼糧；3)納米氧化鋅組，飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg/kg鋅(納米氧化鋅)的試驗飼糧。每組4個重復，每個重復8頭仔豬(公母各占1/2)。試驗期為14 d。仔豬自由采食和飲水，從7日齡開始誘食并哺乳至21日齡斷奶，按常規(guī)程序?qū)ψ胸i進行免疫和飼養(yǎng)管理。

1.4 樣品采集和指標測定

分別于28和35日齡，每組隨機選取8頭仔豬(每個重復2頭，公母各占1/2)，肌肉注射4%戊巴比妥鈉溶液(每千克體重40 mg戊巴比妥納)進行麻醉，待麻醉完全后前腔靜脈采血，肝素抗凝，制備血漿，－70℃保存。屠宰取中段空腸進行腸形態(tài)分析。宰前禁食12 h，禁食期間自由飲水。

1.4.1 生長性能

試驗期內(nèi)每天統(tǒng)計記錄采食量和腹瀉情況，試驗結(jié)束后，禁食12 h(自由飲水)后稱重，計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)和腹瀉率。腹瀉率的統(tǒng)計方法是每天相同時間以重復為單位，記錄腹瀉豬頭數(shù)，計算每天每個重復的腹瀉率(腹瀉頭數(shù)/每個重復的豬總頭數(shù))和試驗期內(nèi)每個重復的腹瀉率平均值。

1.4.2 空腸形態(tài)分析

用剪刀連續(xù)取空腸中段長度約1 cm的腸管，沿腸系膜縱向剪開，用生理鹽水將其輕輕沖洗干凈，平鋪在濾紙上吸干液體，浸入10%的福爾馬林中，4℃保存，用于光鏡分析其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。用德國Leica組織切片設備，將腸段樣品經(jīng)固定、修整、沖洗、脫水、切片(厚度約5 μm)和蘇木精－伊紅(HE)染色制成切片；每個樣品制作3個非連續(xù)性的縱切片和橫切片。用Leica Qwin圖像分析儀對絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度進行顯微測量和分析；每張縱切片測定10個絨毛高度和隱窩深度，取其平均值作為1個測定數(shù)據(jù)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.4.3 血漿D－乳酸和二胺氧化酶(DAO)測定

參考胡彩虹等［13］的方法用分光光度法測定血漿中D－乳酸含量和DAO活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用SAS 6.12的一般線性模型(GLM)進行，以P＜0.05作為差異顯著的判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 生長性能

納米氧化鋅對斷奶仔豬生長性能的影響見表2。與對照組相比，氧化鋅組和納米氧化鋅組斷奶仔豬ADG分別提高了5.60%和7.26%(P＜0.05)，腹瀉率降低了67.96%和70.82%(P＜0.05)；3組斷奶仔豬ADFI和F/G均無顯著差異(P＞0.05)，氧化鋅組和納米氧化鋅組之間生長性能指標差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)

納米氧化鋅對斷奶仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見表3。與對照組相比，納米氧化鋅組仔豬28和35日齡絨毛高度分別提高了12.64%和10.80%(P＜0.05)；28日齡隱窩深度降低了15.42%(P＜0.05)；28和35日齡絨毛高度/隱窩深度分別提高了33.61%和17.11%(P＜0.05)。氧化鋅組和納米氧化鋅組之間空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)各指標均差異不顯著(P＞0.05)。

表2 納米氧化鋅對斷奶仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of nano zinc oxide on growth performance in weaner piglets(n=4)

表3 納米氧化鋅對斷奶仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of nano zinc oxide on jejunum morphology in weaner piglets(n=4)

2.3 血漿D-乳酸含量和DAO活性

納米氧化鋅對斷奶仔豬血漿D－乳酸含量和DAO活性的影響分別見圖2和圖3。與對照組相比，氧化鋅組仔豬28和35日齡血漿D－乳酸含量分別降低了27.91%和19.80%(P＜0.05)，DAO活性分別降低了26.55%和26.15%(P＜0.05)。與對照組相比，納米氧化鋅組仔豬28和35日齡血漿D－乳酸含量分別降低了28.97%和20.23%(P＜0.05)，DAO活性分別降低了28.61%和24.92%(P＜0.05)。氧化鋅組和納米氧化鋅組之間血漿D－乳酸含量和DAO活性均差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 納米氧化鋅對斷奶仔豬血漿D-乳酸含量的影響Fig.2 Effects of nano zinc oxide on plasma D－lactate content in weaner piglets

圖3 納米氧化鋅對斷奶仔豬血漿二胺氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of nano zinc oxide on plasma DAO activity in weaner piglets

3 討論

3.1 納米氧化鋅對斷奶仔豬生長性能的影響

納米氧化鋅是納米量級(1～100 nm)的新型鋅源，已有大量研究報道了其對豬、雞的作用效果［8－12］。本試驗研究了飼糧中添加300 mg/kg鋅(納米氧化鋅)和3 000mg/kg鋅(氧化鋅)對斷奶仔豬生長和腹瀉的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，納米氧化鋅組斷奶仔豬ADG顯著提高，腹瀉率顯著降低，但氧化鋅組和納米氧化鋅組之間差異不顯著，提示納米氧化鋅的使用能節(jié)約鋅的添加量，減輕高鋅給環(huán)境帶來的壓力，這與王之盛等［8］的研究結(jié)果一致。

研究表明，納米微粒由于粒徑較小，表面積增大，與生物膜的黏著性提高，因此有利于增加微粒與腸壁的接觸面積，延長接觸時間，從而有利于吸收；納米微?？诜蟠罅康乇晃改c道派伊爾氏斑(Peyer’s Patches)的M細胞和腸上皮細胞攝取，也可通過細胞旁路途徑或小腸黏膜細胞的胞飲作用而被吸收［14－15］。馬恒東等［9］采用翻轉(zhuǎn)腸囊法研究了仔豬小腸對納米氧化鋅的吸收，發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅的吸收速率顯著高于硫酸鋅和普通氧化鋅。另外，納米氧化鋅具有納米粒子特有的高活性和高表面效應，其表面原子數(shù)量遠高于氧化鋅，具有較高的表面能、極強的電子得失能力和氧化還原性［16］，這些特性增強了納米氧化鋅與細菌的親和力，使其通過抑制細菌電子傳遞鏈中酶活性等方式達到抗菌目的［17］。因此，納米氧化鋅的促生長和抗腹瀉作用與其特殊的吸收特性和抗菌作用有關(guān)。

已有眾多學者開展了納米氧化鋅的安全性研究。吳誠等［18］采用改良寇氏法以灌胃方式研究了納米氧化鋅對小白鼠的急性毒性及其病理變化，測得其半數(shù)致死量(LD50)為1 656 mg/kg。楊輝等［19］發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅對小鼠胚胎成纖維細胞的損傷作用具有明顯的劑量－效應關(guān)系，其半數(shù)致死濃度(24h－IC50)為 21.94 μg/mL。納米氧化鋅對動物的毒性受材料粒徑、形狀、添加劑量等影響。本試驗中添加300 mg/kg鋅(納米氧化鋅)未發(fā)現(xiàn)仔豬表觀上的異常，但納米氧化鋅對仔豬的安全性尚需進一步研究。

3.2 納米氧化鋅對斷奶仔豬腸形態(tài)的影響

鋅作為腸道上皮細胞發(fā)育成熟的必需微量元素，有利于改善腸道形態(tài)，增加蛋白質(zhì)合成和腸道細胞增殖［20］。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，納米氧化鋅組仔豬28和35日齡絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度顯著提高，而氧化鋅組和納米氧化鋅組仔豬之間絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度差異不顯著，說明添加氧化鋅和納米氧化鋅都能保護腸黏膜屏障受損，但添加較小劑量的納米氧化鋅對腸黏膜形態(tài)就具有改善作用，其原因一方面可能是納米氧化鋅具有較強的殺菌能力，有助于維持腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定，另一方面可能是納米氧化鋅更能促進腸道上皮細胞的發(fā)育和增殖［20］。

3.3 納米氧化鋅對斷奶仔豬腸黏膜通透性的影響

DAO是人和哺乳動物小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細胞內(nèi)酶，其活性與黏膜細胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)；D－乳酸是胃腸道固有細菌的代謝終產(chǎn)物，哺乳動物既不產(chǎn)生D－乳酸，也不具備將其快速代謝分解的酶系統(tǒng)。血漿中D－乳酸含量和DAO活性的高低反映腸黏膜的完整性及損傷程度，是監(jiān)測腸道屏障功能的重要指標。當腸黏膜受損時，D－乳酸和DAO從小腸黏膜釋放入血，血液中D－乳酸含量和DAO活性升高。斷奶應激引起仔豬腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加，表現(xiàn)為血液中D－乳酸含量和DAO活性升高［21－22］。本試驗發(fā)現(xiàn)，在28 和35 日齡時，納米氧化鋅組和氧化鋅組仔豬血漿D－乳酸含量和DAO活性均顯著低于對照組，而納米氧化鋅組與氧化鋅組之間差異不顯著。本研究表明，飼糧中添加納米氧化鋅和氧化鋅均能抑制斷奶應激造成的仔豬腸黏膜通透性的增加，保護腸黏膜屏障，飼糧中添加300 mg/kg鋅(納米氧化鋅)或3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)的保護效果無顯著差異。有研究表明，氧化鋅能抑制腸毒性大腸桿菌對腸上皮細胞的黏附和侵入，提高腸上皮細胞緊密連接的完整性，從而保護腸黏膜屏障［23］。納米氧化鋅對仔豬腸黏膜屏障具有更強的保護作用，可能是其納米形式更有助于提高腸上皮細胞緊密連接的完整性，緩解斷奶應激對仔豬腸黏膜屏障的損傷。

4 結(jié)論

①斷奶仔豬飼糧中添加300 mg/kg鋅(納米氧化鋅)能提高仔豬生長性能，降低腹瀉率，改善腸黏膜形態(tài)和保護腸黏膜屏障。

② 飼糧中添加300 mg/kg鋅(納米氧化鋅)和3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)對提高斷奶仔豬生長性能、降低腹瀉率、改善腸黏膜形態(tài)和保護腸黏膜屏障的影響無顯著差異。

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