昌 薇 何少林 林 靜 趙 卉 李大主

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，武漢430022)

現(xiàn)有研究證實(shí)動脈粥樣硬化(AS)為一慢性免疫炎性疾病，血管內(nèi)皮細(xì)胞在經(jīng)受多種危險(xiǎn)因素(如ox-LDL)的刺激、損傷后表達(dá)多種炎性介質(zhì)，激活并誘導(dǎo)各種免疫炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞等)聚集于內(nèi)膜下，參與粥樣斑塊的發(fā)生發(fā)展［1］。他汀類調(diào)脂藥物可延緩和消退動脈粥樣硬化病變，其機(jī)制主要是通過其調(diào)脂作用和一系列非調(diào)脂作用實(shí)現(xiàn)［2］。近期研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可在體抑制冠心病患者樹突狀細(xì)胞的功能［3］，從而達(dá)到抗炎的作用，但這一作用的具體機(jī)制尚不明確。近年對新型細(xì)胞因子——胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，其是樹突狀細(xì)胞最強(qiáng)烈的激活因子，在啟動許多炎癥性疾病的發(fā)病中起“總開關(guān)”的作用［4］，但其是否在動脈粥樣硬化過程中起作用尚未見報(bào)道。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著表達(dá)TSLP，在AS炎癥反應(yīng)的啟動中可能發(fā)揮作用［5］。阿托伐他汀的免疫抑制和抗炎作用是否源于其對血管內(nèi)皮細(xì)胞TSLP表達(dá)的抑制目前尚無研究，本文就此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 新生胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購于Gibco-RBL公司，按照說明書配制，4℃保存，血清在使用前用56℃水浴30分鐘滅活補(bǔ)體后分裝，－20℃保存;氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購于Sigma公司;DMSO購于上海華美生物工程公司;Trizol試劑盒購于Gibco-RBL公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TOYOBO公司;實(shí)時(shí)定量試劑盒購于日本TSKARA公司;TSLP ELISA試劑盒購于Biolegend(San Diego，USA)公司;免疫熒光一抗試劑購于 Abcam(Cambridge，UK)公司，免疫熒光二抗試劑盒及DAPI購于博士德公司。阿托伐他汀為輝瑞公司提供的實(shí)驗(yàn)用藥。

1．2 方法

1．2．1 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮 HUVEC由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院提供。用DMEM/F-12培養(yǎng)液(含10%滅活胎牛血清 ，100 U/L青、鏈霉素)在37℃、飽和空氣濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞長至約80%融合，倒去培養(yǎng)液，PBS洗2～3次，0．25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組 人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)，按如下分組:(1)對照組:加入50 mg/L的ox-LDL后繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí);(2)阿托伐他汀處理低濃度組:加入 50 mg/L的 ox-LDL和阿托伐他汀1 μmol/L后繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí);(3)阿托伐他汀處理高濃度組:加入50 mg/L的ox-LDL和阿托伐他汀10 μmol/L后培養(yǎng)12小時(shí);分別于6小時(shí)和12小時(shí)取上清和細(xì)胞檢測。

1．2．3 ELISA檢測上清液TSLP濃度 操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1．2．4 RT-PCR定量分析TSLP mRNA表達(dá) ①用一步法提取細(xì)胞總RNA:提取的總RNA經(jīng)電泳鑒定未被降解，用72-1分光光度計(jì)測RNA在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，根據(jù)260 nm的吸光度值對樣品的總RNA進(jìn)行初步定量。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):應(yīng)用TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制20 μl反應(yīng)體系，在T gradient梯度PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。③RealTime RT-PCR應(yīng)用TaKaRa實(shí)時(shí)定量試劑盒配制25 μl反應(yīng)體系。TSLP的上游引物:TATGAGTGGGACCAAAAGTACCG;下游引物:GGGATTGAAGGTTAGGCTCTGG;內(nèi)參照GAPDH的上下游引物如下;上游引物:CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA;下游引物:TCTAGACCGCAGGTCAGGTCCACC。在ABI Step one實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。TSLP mRNA相對表達(dá)水平用CT比較法2-△△CT表示。

1．2．5 免疫熒光染色檢測細(xì)胞TSLP表達(dá) 在 6孔板內(nèi)預(yù)置一蓋玻片，接種HUVECs(1×106/孔)，ox-LDL和阿托伐他汀處理6或12小時(shí)后，將含有貼壁細(xì)胞的蓋玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定20分鐘，取出蓋玻片固定于載玻片上，PBS洗3次;加5%BSA封閉液封閉30分鐘，封閉非特異性抗原，吸取余液。PBS漂洗3次;吸去PBS液，滴加第一抗體(TSLP 1∶400濃度稀釋)，每張切片加入50 μl稀釋液，4℃過夜;PBS洗3次，吸去 PBS液，加入CY3-羊抗兔二抗(1∶50)孵育1小時(shí)后流水沖洗3分鐘，PBS洗2次后加DAPI染細(xì)胞核5分鐘，吸出余液后PBS洗3次，用緩沖甘油封片，立即激光共聚焦顯微鏡照相。陰性對照采用PBS代替一抗，其余步驟相同。用IPP軟件對免疫熒光結(jié)果進(jìn)行圖像處理，TSLP陽性表達(dá)用平均積分光密度表示。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，結(jié)果均用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2．1 阿托伐他汀抑制HUVECs TSLP分泌 對照組6小時(shí)和12小時(shí) 的 TSLP濃度分別為(8．94±1．52)和(11．42 ±1．87)pg/ml(圖 1)，表明 TSLP 的表達(dá)呈時(shí)間依賴性;阿托伐他汀低濃度組6小時(shí)與12小時(shí)的 TSLP 濃度為(7．02 ±0．82)，(9．55 ±1．24)pg/ml;阿托伐他汀高濃度組的TSLP濃度分別為(5．69 ±0．64)，(7．32 ±0．93)pg/ml;與同時(shí)間對照組比較，均顯示TSLP濃度的有顯著性下降，P＜0．001;低濃度組與高濃度組間亦有顯著性下降，P＜0．01;并顯示出劑量依賴性。

2．2 阿托伐他汀抑制HUVEC TSLP mRNA表達(dá)

經(jīng)TSLPmRNA定量分析發(fā)現(xiàn)，對照組在6小時(shí)和12小時(shí)TSLPmRNA均有高表達(dá)(圖2)，實(shí)驗(yàn)組和同時(shí)間對照組比較，TSLPmRNA均顯示出顯著性下降(P ＜0．001)，組間有顯著性差異(P ＜0．01)及劑量依賴性。

圖1 對照組和實(shí)驗(yàn)組上清液中的TSLP濃度Fig．1 Release of TSLP protein in cell supernatants in control group and atorvastatin groups

圖2 對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)TSLP mRNA表達(dá)Fig．2 Release of TSLP mRNA by HUVECs in control group and atorvastatin groups

圖3 HUVEC TSLP表達(dá)的免疫熒光染色(×400)Fig．3 Immunofluorescence staining analysis of the expression of TSLP in HUVEC (×400)

2．3 阿托伐他汀抑制HUVEC TSLP的表達(dá) 如圖3所示，對照組HUVEC均顯著表達(dá)TSLP，6小時(shí)和12小時(shí)的平均積分光密度分別為3．429±1．776，4．978±1．525;阿托伐他汀低濃度組在6小時(shí)和12小時(shí)的平均積分光密度為 3．397 ±1．141，4．803 ±1．614;其高濃度組為 3．256 ± 1．686，4．721 ±1．522，均見顯著性抑制TSLP表達(dá)，與同時(shí)間對照組比較，均有顯著性差異(P＜0．001)，組間亦有顯著性差異(P ＜0．01)。

3 討論

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化(AS)是一慢性免疫炎癥性疾病。多種危險(xiǎn)因素(如ox-ldl)通過不同或相似的途徑損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使后者細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集，并觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號瀑布，導(dǎo)致一系列促炎因子表達(dá)，促使樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等各種免疫炎性細(xì)胞活化、遷移、粘附、聚集于內(nèi)膜下，啟動和促進(jìn)血管局部的炎癥反應(yīng)［1，6］。胸腺間質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，在人類其主要表達(dá)于上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞［7］，在心、肝、肺等臟器也見表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TSLP是樹突狀細(xì)胞最強(qiáng)烈的激活因子，在許多炎癥性疾病的發(fā)病如哮喘、過敏性鼻炎、皮膚過敏、慢性阻塞性肺疾病、椎間盤突出癥等的炎癥反應(yīng)中起“總開關(guān)”的作用，其主要生物學(xué)作用是通過State5和State3途徑的激活，增加CD83、CD86、OX40L和MHCⅡ等因子的表達(dá)激活樹突狀細(xì)胞，促進(jìn) T細(xì)胞分化［3，8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，受ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞可明顯表達(dá)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)［4］，后者可以活化樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞分化。在本實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)一步證實(shí)，受ox-LDL刺激后，HUVECs中TSLP的表達(dá)增多呈時(shí)間-劑量依賴性，這說明TSLP在AS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的危險(xiǎn)因素-血管內(nèi)皮損傷-樹突狀細(xì)胞活化-炎性激活這一通道中可能起到重要的作用。

他汀類調(diào)脂藥物可延緩和消退動脈粥樣硬化病變，其機(jī)制主要是通過其調(diào)脂作用和一系列非調(diào)脂作用實(shí)現(xiàn)，起到改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，修復(fù)受損內(nèi)皮，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，抑制炎癥反應(yīng)等作用［9］。他汀類藥物能使內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA表達(dá)增加，同時(shí)可以增強(qiáng)eNOS的活性，從而使一氧化氮增多，對內(nèi)皮起保護(hù)作用［10］。其他作者研究表明阿托伐他汀可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌多種炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子如組織蛋白、白介素6、白介素8及單核細(xì)胞趨化蛋白-1等，作用呈劑量依賴性［11，12］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可降低冠心病患者循環(huán)C-反應(yīng)蛋白(CRP)的水平，抑制樹突狀細(xì)胞的功能［2］，達(dá)到抗炎的作用。但這一作用是否通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞TSLP的表達(dá)介導(dǎo)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過將經(jīng)ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞與不同濃度的阿托伐他汀共培養(yǎng)，用多種方法檢測發(fā)現(xiàn)，HUVECs培養(yǎng)上清中TSLP的濃度，細(xì)胞中TSLP mRNA表達(dá)及胞漿中TSLP的蛋白表達(dá)水平，都較對照組顯著下降，其作用呈劑量依賴性?？紤]到TSLP對樹突狀細(xì)胞的特異的活化作用，我們推測在體阿托伐他汀可能抑制內(nèi)皮細(xì)胞TSLP的分泌，從而間接抑制樹突狀細(xì)胞的激活。不過本實(shí)驗(yàn)中，阿托伐他汀組未觀察到TSLP的表達(dá)呈時(shí)間依賴性減少，分析其原因，可能是由于實(shí)驗(yàn)觀測時(shí)間點(diǎn)的選擇較少，未能顯示出阿托伐他汀對TSLP抑制作用的作用時(shí)間曲線，這將在今后的機(jī)制研究中進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿托伐他汀可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs TSLP的表達(dá)，這可能是阿托伐他汀抗炎，穩(wěn)定動脈粥樣斑塊作用的原因之一。

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