陳 爽 林 靜 崔 善 張慶鎬 (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部，延吉133002)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是世界范圍內(nèi)最為常見的慢性呼吸道疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、環(huán)境、行為、心理和機(jī)體免疫等諸多方面因素。目前認(rèn)為，Th1/Th2亞群數(shù)目和/或功能比例失衡與哮喘的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，而研究表明IL-27與Th1/Th2關(guān)系密切，因此，IL-27成為與哮喘相關(guān)的候選基因。從2007年開始陸續(xù)有學(xué)者報(bào)道IL-27啟動子區(qū)的g.-964位點(diǎn)與哮喘患者易感性的相關(guān)性研究。其中chase等韓國學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-27的g.-964位點(diǎn)可能與韓國人群哮喘易感性相關(guān)［1］，張慶鎬等發(fā)現(xiàn)IL-27p28基因多態(tài)位點(diǎn)g.-964可能與朝鮮族人群哮喘易感性相關(guān)［2］，而邱熔芳等［3］研究發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)與中國漢族人群哮喘無顯著相關(guān)性。為明確IL-27p28基因中g(shù).-964、g.2905和g.4730位點(diǎn)與哮喘人群的相關(guān)性是否具有民族差異和地區(qū)差異，本實(shí)驗(yàn)選用東北地區(qū)漢族200例哮喘患者和111例正常人血液，采用PCR法擴(kuò)增目的基因片段，單堿基延伸法進(jìn)行基因分型分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取200例中國東北地區(qū)漢族哮喘患者作為病例組，其中男82例，女118例，平均年齡32.8歲，來自延邊大學(xué)附屬醫(yī)院和吉林市第二中心醫(yī)院。所有患者符合哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn):①反復(fù)發(fā)作喘息和呼吸困難、胸悶或咳嗽，多與接觸變應(yīng)原病毒感染運(yùn)動或某些刺激物有關(guān);②發(fā)作時雙肺聞及散在或彌漫性以呼氣期為主的哮鳴音;③上述癥狀可自行或治療緩解;④排除可引起喘息或呼吸困難的其它疾病。所收集患者標(biāo)本IgE﹥800 U/ml。對照組為111例中國東北地區(qū)漢族人，男69例，女42例，平均年齡27.8歲，為延邊大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者。無過敏性哮喘及其他過敏性癥狀和病史。所有入選個體均為無血緣關(guān)系的漢族個體、長期生活在東北(生活在東北地區(qū)三代或以上)，無糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病及HLA相關(guān)疾病及家族史。

1.2 方法

1.2.1 人基因組DNA的提取和純化 病例組采用Bioteke凝固血基因組DNA小量提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GeneBank上找到的IL-27的基因序列(NC-000016.9)，用軟件primer5.0設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的包含啟動子區(qū)g.-964T＞C和外顯子區(qū)g.2905T＞G，g.4730T＞C的3對引物。g.-964T＞C引物序列為 5＇-AATGTCCCGGCTGTGTCTGT-3＇(上游引物)，5＇-CTGTGCTGGAAGGGAGACCT-3＇(下游引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長度321 bp;g.2905T＞G引物序列為5＇-GCTCAGCCTGTTGCTGCTTC-3＇(上游引物)，5＇-CTCCACCAGCCCTCACTCAC-3＇(下 游 引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長度375 bp;g.4730T＞C引物序列 5＇-GGGTGTGATATGGCCATCCT-3＇(上游引物)，5＇-GCTCTACCTGGAAGCGGAGG-3＇(下 游 引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長度226 bp。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 10×PCR Buffer(contains no MgCl2)1.5 μl-1，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)1 μl，Ampli Taq Gold(5 U/μl)0.2 μl，Template(50 ng/μl)2 μl，Primer F(20 pmol/L)0.4 μl，Primer R(20 pmol/L)0.4 μl，加滅菌去離子水補(bǔ)足至終體積15 μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 5分鐘;94℃變性 30秒，65℃退火1分鐘，72℃延伸45秒，每個循環(huán)溫度遞減0.5℃，共10個循環(huán);94℃變性30秒，65℃退火1分鐘，72℃延伸45秒，共30個循環(huán);72℃延伸3分鐘，4℃終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物1 μl加緩沖液0.5×TBE，1.0%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色觀察結(jié)果，分析PCR擴(kuò)增情況。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化 取100 μl滅菌去離子水到反應(yīng)孔中，充分吹打混勻后，取100 μl到純化板中，抽空。注意觀察，勿抽過度。加滅菌去離子水100 μl，再次抽空。加滅菌去離子水補(bǔ)到原液量，搖床搖20分鐘。震蕩后離心1 000 r/min 3分鐘。

1.2.5 測序 311例樣本純化后產(chǎn)物均進(jìn)行測序，測序所用試劑盒BigDye Terminator v3.1，測序反應(yīng)在ABI3730自動測序儀中進(jìn)行，由國家人類基因組北方研究中心完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Hardy-weinberg平衡吻合度(HWE)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)出三個多態(tài)位點(diǎn)在哮喘組和對照組中預(yù)期的基因型頻率，確定所選哮喘組和對照組是否可以代表東北漢族群體?；蛐图暗任换蝾l率用直接記數(shù)法依公式算出。應(yīng)用SPSS17.0檢測IL-27三個位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在哮喘組及對照組中是否存在顯著性差異，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增效果 IL-27p28的三個位點(diǎn)啟動子區(qū)域的g.-964T＞C、外顯子區(qū)域的g.2905T＞G和g.4730T＞C應(yīng)用3對引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳20分鐘，在凝膠成像分析儀下成像，所得PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期的產(chǎn)物一致(圖1)。

2.2 IL-27p28基因中查找SNP位點(diǎn)以及大樣本基因分型 對正常人和哮喘患者樣本IL-27p28基因啟動子、外顯子及其附近的內(nèi)含子區(qū)域直接測序(圖2～4)。根據(jù) LD以及 SNPs的位置，在所有合格測序結(jié)果中選擇其中g(shù).-964A＞G互補(bǔ)鏈g.-964T＞C和g.2905T＞G、g.4730T＞C進(jìn)行大樣本基因分型。

圖1 IL-27基因g.－964位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig．1 Electrophoresis result of PCR products on g.－964 site of IL-27 gene

圖2 IL-27p28基因g．－964T＞C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測序圖(TC雜合型)Fig．2 Sequencing map of IL-27p28(g．－ 964T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

圖3 IL-27p28基因g．2905T＞G位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測序圖(TT純合型)Fig．3 Sequencing map of IL-27p28(g．2905T ＞ G)gene PCR products(TT homozygous)

圖4 IL-27p28基因g．4730T＞C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測序圖(TC雜合型)Fig．4 Sequencing map of IL-27p28(g．4730T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

表1 哮喘組與對照組基因型及等位基因頻率Tab．1 Genotype and allele frequencies in asthma and control groups

2.3 IL-27p28的SNPs與哮喘的相關(guān)性分析 本實(shí)驗(yàn)對200名哮喘患者和111名正常人進(jìn)行檢測。由于樣本為三個多態(tài)位點(diǎn)均符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律P＞0.05，證明所收集樣本可以代表群體。組間基因型及等位基因的比較運(yùn)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果IL-27p28的 g.-964T＞C、g.2905T＞G和g.4730T＞C的基因型及等位基因頻率的分布在正常對照組和哮喘組之間的分布均無顯著性差異(表1)。

3 討論

白細(xì)胞介素27(Interleukin 27，IL-27)是由P28和EBi3兩個片段組成的異源二聚體，在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上有較高水平表達(dá)，主要作用于固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞而發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，尤其在調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化與增殖方面具有重要作用［4］。已知CD4+T細(xì)胞活化后，在不同細(xì)胞因子的作用下可分化為Th1或Th2，Th1細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)細(xì)胞免疫;Th2細(xì)胞分秘IL-4，促進(jìn)體液免疫。Th1和Th2細(xì)胞可通過分泌的細(xì)胞因子而互相抑制其分化和增殖，Th2型細(xì)胞應(yīng)答亢進(jìn)是Ⅰ型超敏反應(yīng)的主要致病機(jī)制，而支氣管哮喘恰恰是典型的Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病。IL-27能協(xié)同IL-12促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并促進(jìn) Th0細(xì)胞向 Th1 細(xì)胞分化［5，6］;同時，IL-27 還具有抑制效應(yīng)Th2細(xì)胞功能的作用［7］。因此，IL-27很有可能成為較好的治療Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病的細(xì)胞因子。

Th1/Th2失衡學(xué)說是哮喘發(fā)作的重要免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，在體外實(shí)驗(yàn)中，IL-27可以通過誘導(dǎo)T-bet和IL-12Rβ2的表達(dá)啟動初始T細(xì)胞向Th1的分化［8，9］，另外，IL-27 可以抑制 Th2 特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達(dá)，因而IL-27能夠使Th1/Th2平衡向Th1漂移。而體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，IL-27對免疫反應(yīng)有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，IL-27ra-/-小鼠在受到病原體刺激時，會引起持續(xù)的Th1活化，最終導(dǎo)致組織器官損傷，甚至死亡［10，11］，因此，IL-27 對于抑制過度的免疫反應(yīng)有著重要的意義。綜上所述，IL-27在維持Th1/Th2平衡及抑制過度免疫方面有著重要作用，而IL-27的表達(dá)異常有可能導(dǎo)致免疫性疾病的發(fā)生。

隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析方法大規(guī)模的應(yīng)用，越來越多的哮喘易感基因被鑒定，但由于各種外在和內(nèi)在因素的作用，使這些結(jié)果需要在不同的人群中進(jìn)行重復(fù)和驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)對g.-964A＞G、g.2905T＞G、g.4730T＞C的3個位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行研究，通過病例-對照研究對IL-27基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析，未測到3個多態(tài)位點(diǎn)與中國東北漢族人群哮喘相關(guān)。g.-964A＞G檢測結(jié)果正與中國學(xué)者對漢族人的檢測相一致，與對朝鮮族人檢測的結(jié)果有所不同，故懷疑g.-964 A＞G位點(diǎn)與哮喘易感性之間的關(guān)系可能具有種族特異性，所以該位點(diǎn)在漢族和朝鮮族人群之間重復(fù)性有差別。而g.2905T＞G、g.4730T＞C兩個位點(diǎn)在漢族和朝鮮族人群中基因多態(tài)性與支氣管哮喘均無相關(guān)性，因此這兩個位點(diǎn)可能不是哮喘易感性的相關(guān)位點(diǎn)。支氣管哮喘是多因素誘發(fā)的疾病，目前臨床上無較好的預(yù)防和根治的辦法，IL-27基因多態(tài)性與哮喘相關(guān)性的研究為哮喘的預(yù)防提供了新的遺傳學(xué)研究方向，有望成為部分人群診斷和預(yù)防支氣管哮喘的一種依據(jù)。

1 Chase S C，Li C S，Kim K M et al.Identification of polymorphisms in human interleukin-27 and their association with asthma in a Korean population［J］.J Hum Genet，2007;52(4):355-361.

2 單元春，崔 善，張慶鎬et al.IL-27p28基因多態(tài)性與中國朝鮮族人群哮喘的相關(guān)性［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2011;24(4):435-438.

3 邱熔芳，李際盛，高貴敏et al.IL-27p28基因啟動子區(qū)域-964A＞G位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人群支氣管哮喘的相關(guān)性［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008;46(11):1021-1023，1027.

4 Pflanz S，Hibbert L，Mattson J et al.WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducting receptor for IL-27［J］.J Immumol，2004;172(4):2225-2231.

5 H?lscher C，H?lscher A，Rückerl D et al.The IL-27 receptor chain WSX-1 differentially regulates antibacterial immunity and survival during experimental tuberculosis［J］.J Immunol，2005;174(6):3534-3544.

6 Pirhonen J，Siren J，Julkunen I et al.IFN-α regulates Toll-like receptor-mediated IL-27 gene expression in human macrophages［J］.J Leukoc Biol，2007;82(5):1185-1192.

7 Miyazaki Y，Inoue H，Matsumura M et al.Exacerbation of experimental allergic asthma by augmented Th2 responses inWSX-1-deficientmice［J］.J Immunol，2005;175(4):2401-2407.

8 Hibbert L，Pflanz S，De Waal Malefyt R et al.IL-27 and IFN-alpha signal via Stat1 and Stat3 and induce T-Bet and IL-12Rbeta2 in native T cells［J］.J Interferon Cytokine Res，2003;23(9):513-522.

9 Lucas S，Ghilardi N，Li J et al.IL-27 regulates IL-12 responsiveness of native CD4+T cells through Stat1-dependent and-independent mechanisms［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(25):15047-15052.

10 Hamano S，Himeno K，Miyazaki Y et al.WSX-1 is required for resistance to Trypanosoma ceruzi infection by regulation of Proinflammatory cytokine production［J］.Inununity ，2003;19(5):657-667.

11 Rosas L E，Satoskar A A，Roth K M et al.Interleukin-27R(WSX-1/T-cell cytokine receptor)gene-deficient mice display enhanced resistance to leishmania donovani infection but develop severe liver immunopathology［J］.Am J Pathol，2006;168(1):158-169.