劉 曉 付 蓉 王 珺 王化泉 劉春燕 阮二寶 瞿 文 梁 勇 王國錦 王曉明 劉 鴻 吳玉紅宋 嘉 邢莉民 關(guān) 晶 李麗娟 邵宗鴻 (天津醫(yī)科大學總醫(yī)院血液腫瘤科，天津300052)

獲得性重型再生障礙性貧血(SAA)是一組以貧血、感染、出血為臨床表現(xiàn)的重度骨髓衰竭性疾病，其發(fā)病與CD8+T淋巴細胞功能亢進導致骨髓造血細胞過度凋亡有關(guān)［1］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，SAA患者Ⅰ型淋巴因子白細胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ水平增高，CD8+T細胞比例增加、功能亢進，胞漿內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)增加，血漿中TNF水平增高，且SAA患者外周血活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)亞群之一CD8+HLA-DR+T細胞比例明顯增高，在SAA的免疫發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［2］。本研究擬體外混合培養(yǎng)SAA患者CD8+HLA-DR+T細胞(效應細胞)與正常人去除CD3+T細胞后的骨髓單個核細胞(BMMNC)(靶細胞)，并于培養(yǎng)體系中加入不同濃度TNF-β，通過檢測靶細胞凋亡程度說明TNF-β對CD8+HLA-DR+T細胞損傷骨髓造血細胞的影響;同時檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10水平，觀察TNF-β對CD8+HLA-DR+T細胞分泌細胞因子的作用。

1 對象與方法

1．1 研究對象 病例為我科2011年2月至2011年7月收治的初診SAA患者15例，男8例，女7例，中位年齡23(6～46)歲，診斷符合《血液病診斷及療效標準》中SAA的診斷標準［3］。正常對照15名，均為正常健康人，男9名，女6名，中位年齡26(24～32)歲。研究方案已通過天津醫(yī)科大學倫理委員會批準，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1．2 主要試劑與儀器 鼠抗人CD8、鼠抗人HLADR、鼠抗人CD3單克隆抗體及磁珠分選儀均為德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品;鼠抗人PE-CD8、鼠抗人FITC-HLA-DR、鼠抗人 PE-IgG1、鼠抗人 FITC-IgG1單克隆抗體均為美國BD PharMingen公司產(chǎn)品;FITC標記的細胞膜聯(lián)蛋白(Annexin V＆PI)細胞早期凋亡檢測試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品;IFN-γ、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒為美國RB公司上海分裝產(chǎn)品;流式細胞儀為美國BD公司的BD FACSAria。

1．3 實驗方法

1．3．1 細胞分選 用含肝素的試管取患者及正常成人骨髓10 ml，PBS 2倍稀釋，以淋巴細胞分離液(比重1．077)密度梯度法分離BMMNC。

計數(shù)細胞，患者BMMNC約每1×107個細胞中加人20 μl CD8磁珠抗體，4℃孵育15分鐘后，洗滌2次，磁性條件下過柱，脫離磁場，充分沖洗柱子，收集細胞。每1×107個細胞加入20 μl CD8解離抗體進行解離，5 μl終止抗體終止解離后，加入 20 μl HLA-DR抗體，4℃孵育15分鐘，洗滌2次，磁性條件下過柱后，脫離磁場，充分沖洗柱子，收集細胞。正常成人BMMNC約每1×107個細胞中加人20 μl CD3磁珠抗體，4℃孵育15分鐘后，洗滌2次，磁性條件下過柱，收集陰性細胞。

流式細胞儀檢測分選細胞純度。實驗管加入上述分選所得細胞1×105、鼠抗人FITC-HLA-DR、PECD8各10 μl。對照管加入上述分選所得細胞1×105及相應同型對照各10 μl。4℃避光孵育20分鐘，PBS洗滌2次，上機。

1．3．2 細胞培養(yǎng) 將上述分選所得 SAA患者CD8+HLA-DR+T細胞(效應T細胞)和正常人去除CD3+細胞的BMMNC(靶細胞)平均分成4份，以5×105ml－1細胞濃度置于24孔板中(CD8+HLADR+T細胞與靶細胞比例為1∶1)，實驗組中加入TNF-β，使其終濃度分別為 15、25、50 ng/ml，每孔中加入12%滅活的小牛血清，用完全RPMI1640調(diào)整細胞懸液至每孔2 ml，置于37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)72小時。

1．3．3 細胞凋亡和細胞因子檢測 應用Annexin V＆PI雙標法標記細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。應用ELISA試劑盒分別檢測培養(yǎng)體系上清中IFN-γ、IL-10表達水平。

1．4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行分析，對符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料，用x±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗，以P＜0．05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 流式細胞儀檢測分選細胞 SAA患者效應細胞CD8+HLA-DR+細胞純度均在90%以上，正常對照測定CD3－靶細胞比例在90%以上(圖1)。

2．2 Annexin V＆PI檢測靶細胞凋亡率 流式細胞儀Annexin V＆PI雙染法檢測靶細胞的凋亡情況(見圖2)。左下象限(An－，PI－)代表正?；罴毎?右下象限(An+，PI－)代表早期凋亡細胞;右上象限(An+，PI+)代表壞死細胞和晚期細胞凋亡;左上象限(An－，PI+)代表收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞。從表1可見，15 ng/ml組凋亡率與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);25 ng/ml組凋亡率高于空白組和15 ng/ml組(P均小于0．05);50 ng/ml組凋亡率顯著高于空白組(P＜0．01)和15 ng/ml(P ＜0．05);但是 50 ng/ml組與 25 ng/ml組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

圖1 流式細胞儀檢測分選細胞Fig．1 Purity of cells by MACS

圖2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率Fig．2 Apoptotic rate measured by flow cytometry

表1 各組培養(yǎng)體系靶細胞凋亡率Tab．1 Apoptotic rate(AR)of each group

表2 培養(yǎng)體系上清中IFN-γ、IL-10濃度Tab．2 The levels of IFN-γ and IL-10 in culture supernatant of each group

2．3 ELISA法檢測培養(yǎng)體系上清中IL-10、IFN-γ水平 IL-10水平各組間無顯著差異(P＞0．05);50 ng/ml組上清中IFN-γ水平高于空白組(P＜0．05)，而15 ng/ml組和25 ng/ml組與空白組比較無差異(P ＞0．05)，如表2。

3 討論

SAA是以骨髓造血功能衰竭和高病死率為特征的血液系統(tǒng)重癥。近年來研究發(fā)現(xiàn)SAA患者的髓樣樹突細胞(mDC，DC1)數(shù)量增多，Th1/Th2細胞比例失衡，Th1細胞功能亢進，表現(xiàn)為CD4+T細胞比例增高、CD4+IFN-γ+細胞、CD4+IL-2+細胞比例增高，具有保護作用的NK細胞比例下降、造血負調(diào)控因子IFN-γ、IL-2等分泌增高、CTL比例增高，抗T細胞球蛋白(ATG/ALG)聯(lián)合環(huán)孢菌素(CsA)的強化免疫抑制治療(IST)可使近70%的患者達到完全緩解，進一步證實了SAA患者存在免疫激活及免疫耐受機制的異常，導致造血細胞過度凋亡，進而引起自身免疫性骨髓衰竭［4-9］。

CD8+HLA-DR+T細胞是活化的效應T細胞亞群之一，在T細胞介導的自身免疫性疾病(AID)如多發(fā)性硬化癥(MS)、實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)以及AIDS患者中比例升高，在HIV感染的患兒中比例明顯降低［10，11］。既往我們研究顯示，在SAA患者中CD8+HLA-DR+T細胞比例明顯增高，并隨患者病情緩解呈逐步下降趨勢，可能是導致SAA骨髓衰竭的主要效應T細胞［2］。

TNF-β是由T淋巴細胞在抗原刺激下產(chǎn)生的淋巴因子，廣泛參與炎癥反應、細胞毒作用及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)［12］。TNF分子激活后可引起受體寡聚從而增加與配體結(jié)合時的親和力，在Fas分子相關(guān)蛋白(Fas-associated death dormain，F(xiàn)ADD)分子的作用下，TNF與TNFR相互作用后，TNFR通過多聚化反應激活caspase級聯(lián)反應，并可引起線粒體膜的改變，從而引發(fā)細胞凋亡。目前國內(nèi)外關(guān)于TNF-α的研究較多，但缺乏TNF-β的相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-β能增強SAA患者效應T細胞凋亡骨髓造血細胞的作用，并且呈濃度依賴性，但在較高濃度時其凋亡細胞作用并不隨濃度增大而增高，在25 ng/ml與50 ng/ml間其凋亡細胞作用進入平臺期，提示TNF-β也是CTL損傷骨髓造血靶細胞的重要途徑之一。但該兩組與空白對照組比較雖有統(tǒng)計學意義，然實際數(shù)值差別不大，或是體內(nèi)TNF-β“溫和”的發(fā)揮造血損傷作用的實際反應，該結(jié)論有待進一步研究證實。

INF-γ屬Th1型細胞因子，通過激活單核細胞、淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞而調(diào)節(jié)免疫反應。Gidvani等［13］檢測了與AID有關(guān)的細胞因子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，如 IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β1，發(fā)現(xiàn) SAA患者均存在這些細胞因子的SNP，特別是IFN-γ和TNF-α，高度提示與SAA的發(fā)病有關(guān)。CTL一般通過三種方式殺傷靶細胞:細胞因子(TNF、IFN-γ)途徑;穿孔素、顆粒酶 B途徑;Fas-FasL途徑［14］。本實驗發(fā)現(xiàn)伴隨 TNF-β 濃度增加細胞凋亡率增高，培養(yǎng)體系上清中IFN-γ濃度無相應變化，僅于50 ng/ml組有明顯增加，說明高濃度的 TNF-β可促進 CD8+HLA-DR+T細胞分泌IFN-γ。

IL-10又稱細胞因子生成抑制因子，淋巴細胞(包括CD4+和CD8+T淋巴細胞)、單核細胞、巨噬細胞等髓系細胞是其主要來源，具有強大的免疫抑制及免疫調(diào)控作用，在調(diào)節(jié)腫瘤免疫、炎癥反應及自身免疫反應中具有多重作用。IL-10可以強化、延長體外激活的CTL的抗腫瘤作用，抑制并逆轉(zhuǎn)T細胞的凋亡過程［15-17］。本實驗顯示，不同濃度TNF-β刺激下的CTL分泌IL-10水平無顯著差異，提示IL-10對CTL的正反饋作用在CTL殺傷靶細胞的過程中并非重要機制。

綜上所述，TNF-β在SAA患者CD8+HLA-DR+T細胞殺傷骨髓造血細胞過程中起重要作用，不僅是效應T細胞損傷靶細胞重要方式之一，并可通過加強效應T細胞分泌造血抑制性因子IFN-γ起正反饋調(diào)控作用。

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