孫 懿 胡志德 谷明莉 黃元蘭 薛 苗 郭方宇 鄧安梅

(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海200433)

干燥綜合征(Sj?gren Syndrome，SS)是一種主要發(fā)生于中老年女性的自身免疫性疾病，受累的器官主要是唾液腺和淚腺，長(zhǎng)期的自身免疫性反應(yīng)導(dǎo)致唾液腺和汗腺功能逐漸喪失，患者因而表現(xiàn)出口干、眼干等癥狀［1］。SS可以是原發(fā)性疾病(原發(fā)性干燥綜合征，pSS)，也可以繼發(fā)于其它自身免疫性疾病(繼發(fā)性干燥綜合征，sSS)。

以往的研究表明，Ⅰ型干擾素通路過(guò)度活化是SS發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)［2，3］。外周血高水平的Ⅰ型干擾素增強(qiáng)了SS患者淋巴細(xì)胞和腺體組織內(nèi)多個(gè)干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)，促進(jìn)了自身免疫反應(yīng)的發(fā)展［4-6］。長(zhǎng)期以來(lái)，臨床免疫學(xué)家對(duì)SS外周血高水平Ⅰ型干擾素的來(lái)源進(jìn)行了大量深入的研究，發(fā)現(xiàn)病毒感染可能是引起外周血Ⅰ型干擾素水平增高的原因之一［7］。當(dāng)病毒入侵機(jī)體時(shí)，位于抗原遞呈細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(PRR)，如 TLR家族的TLR3、TLR7/8和TLR9以及RLR家族的 RIG-Ⅰ和MD5等，組成了機(jī)體對(duì)抗病毒感染的第一道防線。這些PRR在感知到病毒后，通過(guò)極為復(fù)雜且精細(xì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，啟動(dòng)宿主的抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素的表達(dá)和釋放，促進(jìn)病原體的清除［8］。Ⅰ型干擾素是把“雙刃劍”，雖然適度的、及時(shí)的Ⅰ型干擾素反應(yīng)有助于病毒的清除，但是過(guò)度的、持續(xù)的Ⅰ型干擾素反應(yīng)則會(huì)導(dǎo)致組織的慢性損傷，引發(fā)自身免疫性疾?。?］。值得注意的是，并非所有的病毒感染患者最終都會(huì)發(fā)展成SS，這表明在pSS發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程中，除了病毒感染這一“外因”以外，機(jī)體免疫系統(tǒng)的固有個(gè)體特性這一“內(nèi)因”還發(fā)揮著不可忽視的作用。

外周血單核細(xì)胞是Ⅰ型干擾素的重要來(lái)源，因此我們提出如下假說(shuō):pSS患者的單核細(xì)胞與健康個(gè)體單核細(xì)胞在分泌Ⅰ型干擾素的能力上可能存在差異，而這種差異可能是導(dǎo)致pSS發(fā)生或發(fā)展的重要因素。在本研究中，我們以Poly I:C刺激pSS患者和健康個(gè)體的單核細(xì)胞，觀察其釋放Ⅰ型干擾素的能力是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2010年2月至2011年8月期間第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院和長(zhǎng)征醫(yī)院風(fēng)濕科收治的新診斷的pSS患者14例，其診斷符合2002年美國(guó)-歐洲聯(lián)合制定的干燥綜合征診療指南［10］，所有pSS患者均無(wú)惡性腫瘤以及血液系統(tǒng)疾病，且最近一月以內(nèi)無(wú)感染性疾病病史。pSS患者男女比例為2/12，年齡為(49.1±11.2)歲。另從同期來(lái)我院進(jìn)行體檢的個(gè)體中選取14名作為健康對(duì)照，健康對(duì)照組男女比例為2∶12，平均年齡為(45.9±13.5)歲。本研究經(jīng)長(zhǎng)海醫(yī)院及長(zhǎng)征醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 于患者和健康對(duì)照治療前采集空腹靜脈血10 ml，2 000 r/min離心10分鐘，收集上層血漿至-80℃保存?zhèn)溆?。采用密度梯度離心法(淋巴細(xì)胞分離液LymphoprepTM購(gòu)自挪威AXIS-SHIELD公司)分離出SS患者和健康對(duì)照者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。之后采用磁珠分選法從部分PBMC中分離出CD14+的單核細(xì)胞，磁珠分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Miltenyi biotec公司，分選過(guò)程按照生產(chǎn)商提供的操作說(shuō)明進(jìn)行。對(duì)于分選得到的CD14+的單核細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定純度在90%以上時(shí)才進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。所有分離得到的CD14+的單核細(xì)胞(陽(yáng)性選擇)、去CD14+單核細(xì)胞的PBMC(陰性選擇)以及未經(jīng)分離的PBMC均凍存于液氮中，待細(xì)胞收集完成后統(tǒng)一復(fù)蘇培養(yǎng)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

待細(xì)胞復(fù)蘇完成后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105ml-1，以含10%胎牛血清或患者/健康對(duì)照血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基置于96孔板中37℃，5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)后，同時(shí)加入終濃度不等的Poly I:C(購(gòu)自Sigma公司)對(duì)細(xì)胞(包括PBMC，去除了單核細(xì)胞的PBMC以及CD14+單核細(xì)胞)進(jìn)行刺激，于刺激后第12和24小時(shí)收集細(xì)胞上清液進(jìn)行 IFN-α和 IFN-β的ELISA檢測(cè)。

1.3 IFN-α 和 IFN-β 的 ELISA 檢測(cè) IFN-α 和IFN-β的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R＆D公司，檢測(cè)過(guò)程按生產(chǎn)商提供的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩組資料間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或者配對(duì)t檢驗(yàn)，多組樣本間的比較采用單因素方差分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS17.0 for Windows中完成，定義P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 pSS患者外周血PBMC對(duì)Poly I:C刺激呈現(xiàn)高反應(yīng)性 我們首先分析Poly I:C刺激誘導(dǎo)pSS患者PBMC表達(dá)和釋放IFN-α和IFN-β的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 μg/ml的 Poly I:C可以誘導(dǎo) pSS患者和健康個(gè)體的 PBMC釋放 IFN-α和 IFN-β，但pSS患者 PBMC釋放 IFN-α和 IFN-β的能力顯著高于健康對(duì)照(圖1A)。我們進(jìn)一步觀察來(lái)自pSS患者和健康個(gè)體的去除了CD14+單核細(xì)胞的PBMC對(duì)50 μg/ml的 Poly I:C的反應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在去除了CD14+單核細(xì)胞的PBMC中，Poly I:C可以誘導(dǎo)其釋放IFN-α和IFN-β，但其釋放水平相對(duì)較低。雖然在部分時(shí)間點(diǎn)上pSS患者與健康個(gè)體間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但該兩組細(xì)胞釋放IFN-α和IFN-β的整體差異不顯著(圖1B)。該結(jié)果提示:pSS患者PBMC對(duì)Poly I:C刺激具有高反應(yīng)性，且這種高反應(yīng)性可能與單核細(xì)胞有關(guān)。

2.2 pSS患者外周血單核細(xì)胞對(duì)Poly I:C刺激呈現(xiàn)高反應(yīng)性 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):50 μg/ml的Poly I:C刺激CD14+單核細(xì)胞可以誘導(dǎo)相對(duì)較高濃度的IFN-α和IFN-β的釋放，且來(lái)自于pSS患者的單核細(xì)胞，其釋放IFN-α和IFN-β的能力顯著高于來(lái)自于健康個(gè)體的單核細(xì)胞(圖2A)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Poly I:C誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放IFN-α和IFN-β具有濃度依賴性(圖2B)。這些結(jié)果表明:Poly I:C刺激下pSS患者單核細(xì)胞分泌Ⅰ型干擾素能力增強(qiáng)。

2.3 pSS患者血清可以增強(qiáng)單核細(xì)胞對(duì)Poly I:C的反應(yīng)性 我們分析了pSS病人或者健康個(gè)體血清對(duì)單核細(xì)胞釋放IFN-α和IFN-β的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):不論是來(lái)自健康個(gè)體的單核細(xì)胞還是來(lái)自pSS的單核細(xì)胞，在含pSS患者混合血清的培養(yǎng)基中，其釋放IFN-α和IFN-β的能力明顯增強(qiáng)(與含健康個(gè)體血清的培養(yǎng)基相比)。另一方面，不論是以含pSS患者混合血清的培養(yǎng)基，還是以含健康個(gè)體血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，pSS患者單核細(xì)胞釋放IFN-α和IFN-β的能力均強(qiáng)于健康個(gè)體單核細(xì)胞(圖3)。這些結(jié)果表明:pSS的患者的血清可以增強(qiáng)Poly I:C誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放IFN-α和IFN-β的能力。

圖1 Poly I:C誘導(dǎo)pSS患者和健康個(gè)體的外周血PBMCs釋放IFN-α和IFN-β(n=14)Fig．1 IFN-α and IFN-β were induced by the peripheral blood cells stimulated with Poly I:C(n=14)

圖2 Poly I:C誘導(dǎo)pSS患者和健康個(gè)體的單核細(xì)胞細(xì)胞釋放IFN-α和IFN-β(n=14)Fig．2 IFN-α and IFN-β were induced by monocytes stimulated with Poly I:C(n=14)

圖3 pSS患者血清可以增強(qiáng)Poly I:C誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放IFN-α和IFN-β的能力(n=4)Fig．3 Serum from pSS patients enhance the production of IFN-α and IFN-β induced by Poly I:C(n=4)

3 討論

單核細(xì)胞是外周血中數(shù)量最多的抗原遞呈細(xì)胞，其細(xì)胞表面表達(dá)了多種模式識(shí)別受體，可以感知外界或者自身的抗原，進(jìn)而發(fā)動(dòng)針對(duì)抗原的免疫炎癥反應(yīng)。已知Poly I:C是一種雙鏈RNA類似物，在抗原遞呈細(xì)胞上的受體主要是TLR3。Poly I:C通過(guò)激活單核細(xì)胞內(nèi)的TLR3可誘導(dǎo)干擾素等多種細(xì)胞因子的表達(dá)。在正常情況下，這是機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)病毒感染的有力武器，因?yàn)楦蓴_素等多種細(xì)胞因子不僅具有直接的抑制病毒復(fù)制的功能，還可以促進(jìn)針對(duì)病毒的獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程。然而，Ⅰ型干擾素(包括IFN-α和IFN-β)的產(chǎn)生與釋放必需受到精細(xì)的調(diào)節(jié)，失控的Ⅰ型干擾素反應(yīng)可能會(huì)引起組織損傷，甚至自身免疫性疾?。?，9］。

本研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者的單核細(xì)胞對(duì)Poly I:C刺激呈現(xiàn)出高反應(yīng)性，表現(xiàn)在接受Poly I:C刺激后，pSS患者的單核細(xì)胞可以釋放較多的IFN-α和IFN-β。pSS患者單核細(xì)胞的這一異常特性可能與pSS的發(fā)生或者發(fā)展密切相關(guān)。雖然目前對(duì)于pSS發(fā)生的根本原因尚不清楚，但是已經(jīng)明確了Ⅰ型干擾素在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用［2，7］。此外，研究發(fā)現(xiàn) pSS的發(fā)生可能與病毒感染有關(guān)［8］。這些已有的研究結(jié)果以及本研究提示我們:在外界抗原刺激下，單核細(xì)胞過(guò)度活化，產(chǎn)生了較高水平的Ⅰ型干擾素可能是pSS發(fā)生或者發(fā)展的原因之一。

同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，采用pSS患者的血清培養(yǎng)單核細(xì)胞本身可以增強(qiáng)Poly I:C誘導(dǎo)IFN-α和IFN-β釋放的能力。這表明:在pSS發(fā)生或者發(fā)展的過(guò)程中，單核細(xì)胞在pSS的發(fā)病進(jìn)程中，除了固有的“高反應(yīng)性”這一內(nèi)因之外，患者血清特有的“輔助活化”功能這一外因仍然不可忽視。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)pSS患者的單核細(xì)胞存在功能異常，且pSS患者的血清可以增強(qiáng)Poly I:C誘導(dǎo)IFN-α和IFN-β釋放的能力。提示我們，在pSS的發(fā)病進(jìn)程中，單核細(xì)胞發(fā)揮著不可忽視的作用，值得深入研究。

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