劉 晶 張 捷 徐 偉 許溟宇 任 錦 閆冰迪 李成玉 馬忠森

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長春130041)

近幾年，過敏性哮喘的發(fā)病率越來越高，而母親的過敏性哮喘病史是后代發(fā)生過敏性疾病的重要危險因素［1，2］。本研究系統(tǒng)地觀察了母親有過敏性哮喘病史的新生兒調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能的狀況，從而進(jìn)一步明確探討這些高風(fēng)險兒童易患過敏性疾病的早期免疫失衡機制，為早期預(yù)防過敏性疾病的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1．1 對象 2005～2010年來自長春市的70例孕婦在產(chǎn)前被招募，經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，并填寫相應(yīng)的調(diào)查表及同意書。在分娩過程中采集新生兒胎兒臍帶血。采用前瞻性雙盲對照研究方法。母親有過敏性哮喘病史的新生兒為哮喘組，母親為健康個體的為對照組。過敏性哮喘診斷按照2006年支氣管哮喘的診斷指南，且皮膚試驗陽性或血清過敏原特異性IgE陽性或有明確的過敏史。最后入選的過敏組為22例(除2例母親分別在孕20～22周和孕28～32周應(yīng)用小劑量吸入糖皮質(zhì)激素外，其余母親均處于哮喘控制階段，未應(yīng)用相應(yīng)藥物)，對照組為40例。兩組新生兒Apgar指數(shù)均正常，種族、胎齡、性別、身高、體重沒有差別。母親的年齡、分娩方式、吸煙人數(shù)比例和分娩及流產(chǎn)次數(shù)在兩組之間也沒有差別。排除標(biāo)準(zhǔn)為:母親患有自身免疫性疾病，在懷孕期間應(yīng)用影響免疫系統(tǒng)藥物，分娩前1個月內(nèi)有感染，應(yīng)用抗生素，在分娩過程中出現(xiàn)異常，或新生兒不健康。

1．2 臍帶血單個核細(xì)胞(Cord blood mononuclear cell，CBMC)的分離和培養(yǎng)條件 所有入組孕婦在分娩后，立即采集新生兒臍帶靜脈血20 ml，肝素抗凝，室溫24小時內(nèi)應(yīng)用Ficoll梯度離心法分離CBMC。每例CBMC均同時分為5個刺激組(見表1)在6孔培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng):

其中，LpA 為 TLR4(Toll like receptor 4，Toll樣受體4)的配體，Ppg為 TLR2(Toll like receptor 2，Toll樣受體2)的配體，以上試劑均為Sigma公司提供。細(xì)胞在37℃，5%CO2條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，收集細(xì)胞和上清液備用。

1．3 細(xì)胞因子檢測 應(yīng)用人類多細(xì)胞因子檢測試劑盒 IL-10、IL-13、IFN-γ(Biorad 公司)在 Luminex檢測儀(BioRad公司)上檢測各種細(xì)胞因子濃度，單位為pg/ml。

1．4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的百分率 細(xì)胞培養(yǎng)3天后，用5 ml RPMI洗滌，然后用RPMI配成1 ×107ml－1濃度的細(xì)胞懸液。加入抗人CD4-FITC抗體(10 μl/1×106細(xì)胞)，抗人 CD25－PC5 抗體(10 μl/1 ×106細(xì)胞)(Beckman Coulter公司)在4℃避光孵育30分鐘。然后按照Foxp3染色試劑盒(Natutec eBioscience公司)的說明書，應(yīng)用Fixation/Permeabilization工作液使細(xì)胞固定和滲透性增強，然后加入抗人Foxp3-PE抗體(20 μl/L×106細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Foxp3染色。最后在流式細(xì)胞儀(BD Biosciences公司)上，檢測CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的百分率。應(yīng)用CellQuest software分析軟件分析結(jié)果。同型IgG對照抗體染色后陽性率均低于0．05。

1．5 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞分離和功能檢測分離胎兒臍帶血中CBMC，然后應(yīng)用CD3+T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec公司，德國)從CBMC中分別分離CD3－T細(xì)胞，CD4+CD25－T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞。以上分離細(xì)胞的純度經(jīng)流式檢測均大于95%。應(yīng)用5 μmol/L CFSE(CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit invitrogen公司，德國)標(biāo)記后的CD4+CD25－T細(xì)胞(2×104/孔)與放射去活化的CD3－T細(xì)胞(4×104/孔)和CD4+CD25+T細(xì)胞(2×104/孔)共同在 PHA(0．8 μg/ml)刺激下培養(yǎng)，與不加入 CD4+CD25+T細(xì)胞的對照組比較。培養(yǎng)3天后，收集上清，檢測細(xì)胞因子濃度，方法同前。收集細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上，檢測CFSE熒光強度，計算新分裂的CD4+CD25－T效應(yīng)細(xì)胞的百分率。抑制率=(不加CD4+CD25+T細(xì)胞組結(jié)果-加CD4+CD25+T細(xì)胞組結(jié)果)/不加CD4+CD25+T細(xì)胞組結(jié)果。

表1 各組培養(yǎng)條件Tab．1 Culture conditions of different stimuli

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)應(yīng)用SigmaStat1．0軟件分析。計量數(shù)據(jù)根據(jù)是否呈正態(tài)分布，分別采用t檢驗或Mann-Whitney秩和檢驗。

2 結(jié)果

2．1 哮喘組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量在Ppg刺激后低于對照組 在無刺激時及PHA和LpA刺激后，哮喘組和對照組新生兒淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率無明顯差別。但Ppg刺激后，哮喘組淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的百分率明顯低于對照組(1．16±0.36 vs 1．76±0．36，t=1．86，P=0．03)，見表 2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明母親的過敏性哮喘病史使新生兒調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在Ppg誘導(dǎo)的TLR2免疫反應(yīng)途徑上數(shù)量下調(diào)。

表2 CD4+CD 25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量(%)Tab．2 The percentage of CD4+CD25+Foxp3+T cells in CBMC of offspring of non-asthma(control)and asthma(asthma)mothers(%)

2．2 哮喘組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10的分泌在Ppg刺激后低于對照組 在哮喘組和對照組，幾種刺激均可增加IL-10、IL-13和IFN-γ在CBMC中的分泌濃度(與無刺激組比較，P均＜0．05)。無刺激時和PHA、LpA和Derf1刺激后，哮喘組和對照組各種細(xì)胞因子的分泌無差別。但Ppg刺激后，哮喘組CBMC分泌IL-10濃度小于正常對照組新生兒(837 vs 1312，T=2025，P=0．03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。哮喘組分泌IL-13濃趨向于大于對照組(31．7 vs 19．1，T=1351，P=0．1，見表 3)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而對于IFN-γ的分泌濃度，在二組之間無差別(P＞0．05)，說明母親的過敏性哮喘病史使新生兒在TLR2免疫途徑上IL-10分泌下調(diào)，而同時存在IL-13產(chǎn)生增多的趨勢。

2．3 哮喘組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外對效應(yīng)細(xì)胞的抑制功能低于對照組 對照組新生兒的CD4+CD25－T效應(yīng)細(xì)胞與CD3－T細(xì)胞在PHA刺激后共同培養(yǎng)后，81．6%效應(yīng)細(xì)胞分裂增殖，但在加入 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞共同培養(yǎng)組，只有68．9%效應(yīng)細(xì)胞分裂增殖，故CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞對于效應(yīng)細(xì)胞增殖的抑制率為20．9%(算法見1．5)，而在哮喘組抑制率僅為3．2%(見表4)，明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(20．9%vs 3．2%，t=2．42，P=0．05)。此外，在哮喘組 CD4+CD25+T 調(diào)節(jié)性細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞分泌IL-13的抑制率也趨向于低于對照組(79．1%vs 51．6%，t=1．88，P=0．07)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。而CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-γ抑制作用在二組之間無差別(t=0．87，P=0．57)，說明母親的過敏性哮喘病史使新生兒調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞尤其Th2細(xì)胞的抑制功能下調(diào)。

3 討論

母親過敏病史對后代的影響可以從新生兒期甚至胚胎期開始，然而這種影響的免疫機制尚不十分明確。除了傳統(tǒng)上的Th1/Th2細(xì)胞途徑失衡學(xué)說外，近些年調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在過敏性哮喘的發(fā)病機制中所起的作用日益受到重視。而母親的哮喘病史對新生兒免疫反應(yīng)的影響則可能表現(xiàn)在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異常上［3］。對于新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育，環(huán)境因素起到很重要作用，例如在富含微生物的生活環(huán)境中成長起來的兒童患過敏性疾病的風(fēng)險相對較小［4，5］。這種影響主要與TLR2和TLR4免疫途徑相關(guān)聯(lián)［6，7］。本研究在體外應(yīng)用LpA和Ppg分別誘導(dǎo)新生兒的TLR4和TLR2先天性免疫反應(yīng);同時也應(yīng)用PHA和Derp1刺激新生兒免疫反應(yīng)，然后系統(tǒng)地研究了哮喘組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘組新生兒臍帶血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能均下調(diào)，并存在對Th2細(xì)胞的抑制功能的部分缺失，這可能部分解釋母親有過敏性哮喘病史的兒童更易患哮喘等過敏性疾病的原因，而這種易患性可能從新生兒甚至胎兒時期就已經(jīng)開始。

表3 細(xì)胞因子IL-10和IL-13產(chǎn)生濃度(pg/ml)Tab．3 The production of cytokines IL-10 and IL-13(pg/ml)in CBMC of offspring of non-asthma(control)and asthma(asthma)mothers

表4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞的抑制功能Tab．4 The suppressive capacity of CD4+CD25+T reg cells on CD4+CD25 －T effector cells in CBMC of control and asthma mothers

生命早期免疫系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展對于兒童今后是否易患過敏性疾病至關(guān)重要［3，4］，因此我們可以認(rèn)為母親的哮喘病史可能通過兩種途徑導(dǎo)致新生兒免疫功能異常:一種是在胚胎時期受子宮內(nèi)膜及胎盤免疫環(huán)境的影響，另外一種是通過遺傳作用。這兩種作用均可影響新生兒的免疫細(xì)胞。目前除了傳統(tǒng)的Th1/Th2免疫失衡學(xué)說外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在過敏性哮喘發(fā)病及治療機制中的作用日益受到重視［8-10］，尤其在新生兒免疫未成熟期，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能在Th1/Th2軸向分化過程中起到重要調(diào)節(jié)作用。

CD4+CD25+是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較常用的表面標(biāo)志，而Foxp3則是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最特異的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3可控制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化和發(fā)展［11］;IL-10是分泌性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相對特異的細(xì)胞因子。本研究選用了以上這幾種標(biāo)志，并應(yīng)用不同的實驗方法從基因表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志染色及細(xì)胞因子分泌等不同層面檢測了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能情況，結(jié)果具有一致性，即與對照組相比，哮喘組新生兒的CD4+CD 25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量，IL-10分泌濃度在TLR2免疫途徑上(Ppg刺激后)均存在一定的免疫缺陷，在PHA刺激后中也部分降低。同時我們體外分離CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，與CD4+CD25－效應(yīng)性T細(xì)胞共同培養(yǎng)，以檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能，同樣發(fā)現(xiàn)在哮喘組新生兒調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能在PHA刺激后也被下調(diào)。

為了進(jìn)一步探討這種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能的缺陷對其他免疫細(xì)胞的作用，本研究同時也檢測了母親過敏性哮喘病史對新生兒Th1和Th2細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR2免疫途徑上，哮喘組新生兒CBMC分泌IL-13的濃度趨向于低于對照組，而IFN-γ分泌濃度在兩組間無差別。在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能研究中，來自于哮喘組新生兒的CD4+CD 25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞活化后分泌IL-13能力的抑制作用低于對照組，這提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能和數(shù)量下調(diào)，對于Th2細(xì)胞的抑制作用減弱，從而使Th2細(xì)胞反應(yīng)相對增強［9］，這可能導(dǎo)致新生兒將來患過敏性哮喘的風(fēng)險增加。

從本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異常在TLR2免疫途徑上表現(xiàn)得較明顯。而在過敏性疾病發(fā)病的衛(wèi)生環(huán)境假說中，研究表明生命早期生活環(huán)境中微生物含量增加，可通過TLR2免疫途徑影響嬰幼兒免疫系統(tǒng)，Th1免疫途徑增強，Th2免疫途徑相對減弱，從而向不易患過敏性疾病的方向發(fā)展［4-6］，這提示我們可以探索通過TLR2免疫途徑，早期干預(yù)這些母親有哮喘病史的新生兒的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異常，從而達(dá)到早期預(yù)防過敏性疾病的目的。

總之，母親有過敏性哮喘病史的新生兒臍帶血中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能存在一定程度上的缺陷，以上發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步深入研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在過敏性哮喘發(fā)病中的機制及早期預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

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