劉 潔 候明輝 劉 莉 張 耀 孟 杰 郭雅卿 李鴻燕

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，保定071000)

早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子(The early growth responsive gene-1，EGR-1)為即刻早期反應(yīng)基因(Immediate early genes，IEGs)家族中最重要的一員，在神經(jīng)、循環(huán)、泌尿、呼吸等多個(gè)系統(tǒng)控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡[1]。研究表明，在大鼠抗Thy-1.1抗體腎炎模型中，EGR-1在系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)形成的高峰期表達(dá)上調(diào)，表明其通過(guò)調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)聚積參與了腎小球硬化過(guò)程[2]。但是，其具體的作用機(jī)制尚不明了。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，糖尿病腎病時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)及血小板源性生長(zhǎng)因子-B(PDGF-B)表達(dá)增加，可促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖，在糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前關(guān)于EGR-1與TGF-β、PDGF-B的關(guān)系，及其在DN發(fā)病機(jī)制中的作用國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外轉(zhuǎn)染EGR-1基因，觀察高糖環(huán)境下EGR-1基因?qū)ο的ぜ?xì)胞TGF-β、PDGF-B表達(dá)及Ⅳ型膠原分泌的影響，探討EGR-1與系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示EGR-1在DN發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎臟系膜細(xì)胞株SV40MES13由美國(guó)模式菌種收集中心提供;pcDNA3.1-Egr-1、pc DNA3.1由美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)公司提供;LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco BRL公司);胎牛血清(杭州四季青公司);潮霉素 B(Roche公司);兔抗小鼠EGR-1單克隆抗體(Santa Cruz公司);兔抗小鼠TGF-β、PDGF-B單克隆抗體(Santa Cruz公司);Ⅳ型膠原ELISA試劑盒、MTT(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的小鼠系膜細(xì)胞迅速?gòu)?fù)蘇后轉(zhuǎn)入25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)靜置培養(yǎng)24～48小時(shí)，待細(xì)胞充分貼壁后每隔2～3天換液1次，約3～5天細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底進(jìn)行細(xì)胞傳代。系膜細(xì)胞生長(zhǎng)至75%～85%融合，分別用無(wú)血清DMEM/F12傳統(tǒng)培養(yǎng)基洗一次，換無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24小時(shí)，使細(xì)胞同步化，分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即正常對(duì)照組(A組，非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞，5.5 mmol/L葡萄糖環(huán)境)、高糖組(B組，非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞，30 mmol/L葡萄糖環(huán)境)、高糖+空質(zhì)粒組(C組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的系膜細(xì)胞，30 mmol/L葡萄糖環(huán)境)和高糖+EGR-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(D組，轉(zhuǎn)染EGR-1質(zhì)粒的系膜細(xì)胞，30 mmol/L葡萄糖環(huán)境)(按Lipofectamine 2000說(shuō)明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染)，于12、24、48小時(shí)末收集各組細(xì)胞上清液，-80℃保存，用于Ⅳ型膠原的測(cè)定。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，將各瓶液體倒干，然后加入預(yù)冷的裂解液300 μl，冰浴靜置1小時(shí)，然后4℃、14 000 r/min離心25分鐘，吸取上清。采用考馬司亮藍(lán)法測(cè)定上清液蛋白濃度，分裝，-80℃保存。

1.2.2 MTT法檢測(cè)小鼠系膜細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的系膜細(xì)胞以密度1×105ml-1接種于96孔板內(nèi)，100 μl/孔，培養(yǎng) 24小時(shí)后，用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞同步于G0期，然后棄上清，按上述分組給予高糖刺激，分別作用12、24、48小時(shí)后測(cè)系膜細(xì)胞的增殖。于各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4小時(shí)加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄去上清，每孔加入150 μl DMSO終止反應(yīng)，振蕩溶解，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處讀取吸光度(A)值。試驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)各組系膜細(xì)胞中EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白表達(dá) 采用6孔板細(xì)胞爬片，分別于12、24、48小時(shí)終止培養(yǎng)，細(xì)胞用0.01 mol/L PBS沖洗數(shù)次，4%多聚甲醛固定30分鐘;蒸餾水和PBS各沖洗5分鐘;3%H2O2甲醇室溫孵育10分鐘滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;PBS沖洗2次，每次5分鐘;0.1%Trix X-100打孔37℃，20分鐘，PBS沖洗2次，每次5分鐘;正常山羊血清37℃封閉45分鐘;滴加1∶150稀釋的一抗，4℃過(guò)夜(PBS代替一抗做陰性對(duì)照);PBS沖洗，5分鐘×3次;滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育25分鐘;PBS沖洗，5分鐘×3次;滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，37℃孵育20分鐘;PBS沖洗，5分鐘×3次;DAB顯色，鏡下觀察顯色情況;蒸餾水沖洗，終止顯色;梯度酒精脫水，透明、封片。每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)6孔細(xì)胞。

1.2.4 Western印跡法檢測(cè)各組系膜細(xì)胞中EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白表達(dá) 每個(gè)樣品取50 μg總蛋白，加6×SDS加樣緩沖液，在沸水中變性4分鐘，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉37℃封閉PVDF膜1.5小時(shí)，一抗(EGR-1 一抗工作液濃度為 1∶200，TGF-β、PDGF-B一抗工作液濃度為1∶300，GAPDH一抗工作液濃度為1∶500)，4℃過(guò)夜。TTBS洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或小鼠二抗(1∶18 000稀釋)，37℃孵育2小時(shí);TTBS洗膜，滴加ECL試劑，將PVDF膜放入X光片暗盒，在暗室中壓片，顯影，定影。用美國(guó)UVP公司LabWorks 4.5軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定量分析，讀取積分光密度值(IOD)。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorben assay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中的Ⅳ型膠原含量 待細(xì)胞培養(yǎng)終止后收集培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5分鐘以除去培養(yǎng)液中的細(xì)胞成分，取上清液以備檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采取雙抗體夾心ABC-ELISA法。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 EGR-1促進(jìn)小鼠系膜細(xì)胞的增殖 從12小時(shí)開始，B組較A組小鼠系膜細(xì)胞吸光光度值開始升高，48小時(shí)達(dá)到高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，C組和B組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但D組變化趨勢(shì)更明顯，與C組和B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 各組系膜細(xì)胞 EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白表達(dá) 免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示:從12小時(shí)開始，B組較A組小鼠系膜細(xì)胞EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白水平開始升高，隨時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)更明顯，且此趨勢(shì)持續(xù)到48小時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，C組和B組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但D組變化趨勢(shì)更明顯，與C、B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1～6。

2.3 EGR-1誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原的分泌從12小時(shí)開始，B組小鼠系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度較A組開始升高，48小時(shí)達(dá)到高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，C組與B組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但D組系膜細(xì)胞上清液中

Ⅳ型膠原濃度升高最明顯，與其他組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表1 EGR-1對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞增殖的影響(±s，n=6)Tab．1 Effects of EGR-1 on proliferation of glomerular mesangial cell(±s，n=6)

表1 EGR-1對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞增殖的影響(±s，n=6)Tab．1 Effects of EGR-1 on proliferation of glomerular mesangial cell(±s，n=6)

Note:A.NG;B.HG;C.HG+pcDNA3.1;D.HG+pcDNA3.1-Egr-1.1)P＜0.01 vs group A;2)P＜0.05 vs group B and C.

Groups 12 h 24 h 48 h A 0.231±0.004 0.342±0.005 0.470±0.004 B 0.436±0.0061) 0.639±0.0051) 0.737±0.0061)C 0.428±0.0041) 0.637±0.0041) 0.753±0.0051)D 0.648±0.0052) 0.859±0.0092) 0.947±0.0102)

表2 各組細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(μg/L，±s，n=6)Tab．2 Concentration of type Ⅳ collagen in the supernatant of mesangial cells of every group(μg/L，±s，n=6)

表2 各組細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(μg/L，±s，n=6)Tab．2 Concentration of type Ⅳ collagen in the supernatant of mesangial cells of every group(μg/L，±s，n=6)

Note:A.NG;B.HG;C.HG+pcDNA3.1;D.HG+pcDNA3.1-Egr-1.1)P＜0.01 vs group A;2)P＜0.05 vs group B and C.

Groups 12 h 24 h 48 h A 6.33±0.125 7.04±0.78 8.15±1.12 B 11.05±1.031) 13.06±1.001) 16.08±0.881)C 10.99±1.161) 12.73±0.431) 15.96±0.491)D 13.48±0.962) 15.69±0.502) 19.16±0.712)

圖1 高糖培養(yǎng)48小時(shí)后各組系膜細(xì)胞EGR-1的表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)，×400)Fig．1 Immunocytochemical staining for EGR-1 in glomerular mesangial cells after 48 hours(×400)

圖2 高糖培養(yǎng)48小時(shí)后各組系膜細(xì)胞TGF-β的表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)，×400)Fig．2 Immunocytochemical staining for TGF-β in glomerular mesangial cells after 48 hours(×400)

圖3 高糖培養(yǎng)48小時(shí)后各組系膜細(xì)胞PDGF-B的表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)，×400)Fig．3 Immunocytochemical staining for PDGF-B in glomerular mesangial cells after 48 hours(×400)

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)各組系膜細(xì)胞EGR-1的蛋白表達(dá)(Western印跡)Fig．4 Western blot for EGR-1 protein in glomerular mesangial cells in every group

3 討論

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因。腎小球系膜細(xì)胞具有收縮、吞噬和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)等多種功能，在維持腎臟正常生理功能及腎臟病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。系膜細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶(絲氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶等)和蛋白酶抑制劑(絲氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶組織抑制劑等)。正常生理?xiàng)l件下，它們之間處于一種動(dòng)態(tài)平衡。但在糖尿病狀態(tài)下，高糖、血管緊張素Ⅱ、炎癥、氧化應(yīng)激產(chǎn)物等有害刺激作用下，蛋白酶的功能減退或蛋白酶抑制劑活性增強(qiáng)時(shí)，就會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和腎小球硬化。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)各組系膜細(xì)胞TGF-β的蛋白表達(dá)(Western印跡)Fig．5 Western blot for TGF-β protein in glomerular mesangial cells in every group

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)各組系膜細(xì)胞PDGF-B的蛋白表達(dá)(Western印跡)Fig．6 Western blot for PDGF-B protein in glomerular mesangial cells in every group

早期生長(zhǎng)反應(yīng)元件(Early growth response-1，EGR-1)也稱為NGFI-A、zif268、krox-24 及TIS8，為鋅指轉(zhuǎn)錄因子，也是即刻反應(yīng)基因(Immediate-early gene)的產(chǎn)物[4，5]，位于人的第5 對(duì)染色體 q23-31，長(zhǎng)2.1 kb，編碼3.3 kb成熟的mRNA，其下游為EGR-1基因的外顯子區(qū)域，編碼由543個(gè)氨基酸組成的EGR-1蛋白產(chǎn)物，分子量為80～82 kD。人與小鼠的EGR-1基因在核酸與蛋白水平方面的同源性分別為87%和94%。EGR-1中心區(qū)域尚有三個(gè)完全一致的半胱氨酸/組氨酸型鋅指結(jié)構(gòu)，與富含GC的DNA序列特異結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用[6]。

EGR-1僅在快速反應(yīng)的器官表達(dá)，而在慢反應(yīng)的器官和組織表達(dá)卻很弱，甚至不表達(dá)。在成熟小鼠的腦、甲狀腺、心臟、肺、腎等部位呈高表達(dá)，而肝、脾、睪丸等為低表達(dá);在人體組織中只有少數(shù)器官，包括腦、心、肺能達(dá)到相對(duì)高的水平，在人體正常的乳腺組織中亦可檢測(cè)到EGR-1的高表達(dá)[7，8]。在多種刺激物如電離射線、紫外線照射、張力刺激、低氧、缺血/再灌注損傷、化療藥物、多肽生長(zhǎng)因子、切應(yīng)力和尿素等的作用下可見到EGR-1表達(dá)增加，使細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖[9]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，在泌尿系統(tǒng)已有研究發(fā)現(xiàn)在單側(cè)輸尿管梗阻致腎間質(zhì)纖維化模型，應(yīng)用電穿孔技術(shù)使DNA酶導(dǎo)入成纖維細(xì)胞特異地阻斷EGR-1表達(dá)，相應(yīng)地減少了TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)，減少了肌成纖維細(xì)胞形成，抑制了腎間質(zhì)纖維化[1，2]。此外EGR-1在系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)積聚性病變中表達(dá)明顯，在系膜細(xì)胞肥大、增生和系膜基質(zhì)增多等方面起著重要作用，在體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞中EGR-1表達(dá)升高可促使系膜細(xì)胞增殖，應(yīng)用反義寡核苷酸將EGR-1阻斷后，系膜細(xì)胞增殖降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常糖組相比較，高糖組腎小球系膜細(xì)胞EGR-1基因表達(dá)升高，系膜細(xì)胞增殖及Ⅳ型膠原分泌明顯;與高糖組相比較，EGR-1基因轉(zhuǎn)染組系膜細(xì)胞增殖及Ⅳ型膠原分泌更加顯著，說(shuō)明高糖可促進(jìn)EGR-1基因高表達(dá)，EGR-1基因可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的增殖及Ⅳ型膠原分泌。Soon等[10]研究證明EGR-1可通過(guò)上調(diào)系膜細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)系膜外基質(zhì)沉積，加重腎小球硬化，與上述研究結(jié)果一致。

研究表明，EGR-1也是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)[11]。寡核苷酸為基礎(chǔ)的基因芯片分析揭示了依賴于EGR-1的基因數(shù)目超過(guò)300個(gè)[12]。在許多基因的啟動(dòng)子中都有功能性EGR-1的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)與靶基因結(jié)合，EGR-1可調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞生長(zhǎng)分化和細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞趨化、免疫刺激等相關(guān)的多種基因表達(dá)。其可調(diào)控細(xì)胞間黏附分子-1(Intercelluaradhesionmolecule-1，ICAM-1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet derived growth factor，PDGF)A/B鏈、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)、組織因子(Tissue factor，TF)、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(Urokinase-type plasminogen activator，u-PA)，bFGF、IL-2、TNF-α、CD44，以及 EGR-1 自身啟動(dòng)子的表達(dá)，從而發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)通路中介作用[13，14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖刺激下腎小球系膜細(xì)胞 EGR-1、TGF-β、PDGF-B 表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染 EGR-1基因后，系膜細(xì)胞TGF-β和PDGF-B表達(dá)升高更加顯著，提示EGR-1可促進(jìn)TGF-β、PDGF-B的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌，加速腎小球硬化，進(jìn)而在DN腎損害和纖維化中起重要作用，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，目前對(duì)EGR-1基因具體的生物學(xué)功能尚不清楚，探討EGR-1基因高表達(dá)對(duì)腎小球系膜細(xì)胞TGF-β和PDGF-B的表達(dá)及系膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響，對(duì)進(jìn)一步明確EGR-1基因在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制具有重要意義，將為臨床提供糖尿病腎病早期干預(yù)的新靶點(diǎn)，為人類防治糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

1 Gerhard H，Claudia G，Vikas P et al.Transcription factor Egr-1 regulates glomerular mesangial cell proliferation[J].Biol Chem，1996;271(45):28306-28310.

2 Harald D，Rupprecht，Yoshitaka A et al.Nitric oxide inhibits growth of glomerular mesangial cells:Role of the transcription factor EGR-1[J].Kidney International，1999;57(2000):70-82.

3 Kanwar Y S，Wada J，Sun L et al.Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression[J].Exp Biol Med，2008;233(1):4-11.

4 Blaschke F，Bruemmer D，Law R E.Egr-1 is a major vascular pathogenic transcription factor in atherosclerosis and restenosis[J].Rev Endocr Metab Disord，2004;5(3):249-254.

5 Khachigian L M.Early growth response-1 in cardiovascular pathobiology[J].Circ Res，2006;98(2):186-191.

6 Yifan Lu，Tong Li，Hamid Y et al.Early growth response 1(Egr-1)regulates phosphorylation of microtubule-associated protein tau in mammalian brain[J].Biol Chem，2011;286(13):20569-20581.

7 莊楚香，吳名耀.Egr-1在小鼠和人體正常組織中的表達(dá)及其生理學(xué)功能[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001;14(3):166-168.

8 吳名耀，莊楚香.Egr-1在小鼠和人組織中的表達(dá)及其與細(xì)胞增殖的關(guān)系[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2002;11(1):72-74.

9 Danuta S，Bernd G，Christina S et al.Mycophenolic acid inhibits the autocrine PDGF-B synthesis and PDGF-BB-induced mRNA expression of Egr-1 in rat mesangial cells[J].Nephrol Dial Transplant，2009;24(1):52-61.

10 Soon Y，Ji H，Andrew B et al.Transcription factor Egr-1 is essential for maximal matrix metalloproteinase-9 transcription by tumor necrosis factor[J].Mol Cancer Res，2010;8(4):507-519.

11 Khachigian L M.Early growth response-1 in cardiovascular pathobiology[J].Circ Res，2006;98(2):186-191.

12 Frédéric B，Simon D，Katherine B et al.EGR-1 activation by EGF inhibits MMP-9 expression and lymphoma growth[J].Blood，2010;116(5):759-766.

13 Yunlu Xu，F(xiàn)atouma T，Wu Qu et al.Advanced glycation end product(AGE)-receptor for AGE(RAGE)signaling and up-regulation of egr-1 in hypoxic macrophages[J].Biol Chem，2010;285(30):23233-23240.

14 Ossie F，Dyson，Christopher M et al.Interferon tau regulates PGF2 release from the ovine endometrial epithelial cells via activation of novel JAK/EGFR/ERK/EGR-1 pathways[J]Biol Chem，2010;285(11):37491-37502.