HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin在人乳腺癌中的表達(dá)及其意義①

龍方懿 印國兵 劉智敏 楊俊艷 賈朝莉 劉小花 董超然 王 旎

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

乳腺癌在全球范圍內(nèi)一直位居女性惡性腫瘤的首位，且呈逐年上升趨勢，大大危害著女性健康，乳腺癌的發(fā)展受多因素的調(diào)控。

在腫瘤細(xì)胞增殖過程中，缺氧是實(shí)質(zhì)性腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一［1］，細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)主要是由低氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)來調(diào)節(jié)的。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基構(gòu)成，HIF-1β組成性表達(dá)，而HIF-1α作為氧調(diào)節(jié)亞基，決定著HIF-1的活性，HIF-1α的過表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs)是一類低分子量高半胱氨酸含量的非酶金屬結(jié)合蛋白質(zhì)家族，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用。鈣黏蛋白E(E-cadherin)是鈣依賴性介導(dǎo)細(xì)胞間連接的黏附分子，其表達(dá)的下調(diào)或喪失是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的特征之一，而Slug作為Snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可通過與E-cadherin啟動(dòng)子的E-box結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［3］。

目前，有關(guān) HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在乳腺癌中的表達(dá)及其相關(guān)性研究報(bào)道甚少，本研究通過采用免疫組化SP法與RT-PCR檢測乳腺癌中HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)情況，進(jìn)而探討HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin能否作為監(jiān)測乳腺癌發(fā)展的指標(biāo)。

1 材料與方法

1．1 材料 69例2009年2月～2010年10月手術(shù)后經(jīng)病理診斷為乳腺癌的組織標(biāo)本來自于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科。按WHO乳腺腫瘤組織學(xué)類型分類標(biāo)準(zhǔn):浸潤性導(dǎo)管癌48例，浸潤性小葉癌21例。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(2003):Ⅰ期3例，Ⅱ期48例，Ⅲ期18例，Ⅳ期0例。所有患者均是女性，年齡26～79歲，中位年齡49歲，全部患者術(shù)前未接受放療、化療及激素治療。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-231均來自于本實(shí)驗(yàn)室。

1．2 主要試劑 鼠抗人Slug單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品;鼠抗人MT單克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品;兔抗人HIF-1α多克隆抗體為Millipore公司產(chǎn)品;兔抗人E-cadherin多克隆抗體、DAB試劑盒和免疫組化SP法試劑盒均購于北京中杉金橋公司;總RNA提取RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、Premix Taq DNA酶購自TaKaRa公司;RT-PCR引物由TaKaRa公司合成。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 免疫組化SP法 采用鏈霉親和素-過氧化物酶法(SP法)。標(biāo)本均經(jīng)過10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，切片分別作免疫組化染色和HE染色，免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均按照說明書進(jìn)行。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS替代一抗作陰性對照。

1．3．2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌 MCF-7與 MDA-MB-231細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%新生小牛血清(四季青公司)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)中，置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3．3 細(xì)胞總 RNA 提取 按照 RNAiso Plus(TaKaRa公司)試劑說明書要求操作，分別提取人乳腺癌MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞總RNA，所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad)定量并檢測其純度，純度為OD260/OD280≥1．8的總RNA提取物用于后續(xù)試驗(yàn)。

1．3．4 RT-PCR PCR 引物序列見表1，RT-PCR 反應(yīng)按說明書進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并拍照，以DL1000 DNA Maker(TaKaRa公司)為參照，采用Quantity One軟件對RT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行圖像分析。

1．4 結(jié)果判定 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用半定量法進(jìn)行判定:光鏡下每張切片選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，胞核、胞漿或胞膜染色為棕黃色或深棕黃色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，計(jì)算每張切片5個(gè)高倍視野中陽性細(xì)胞的平均百分率，陽性細(xì)胞平均百分率＜10%為陰性表達(dá)病例，陽性細(xì)胞平均百分率≥10%為陽性表達(dá)病例。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳后用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)掃描各電泳條帶的平均光密度值并測量其面積，獲得幾何平均光密度?；虮磉_(dá)用相對光密度表示:檢測基因光密度/管家基因光密度。

表1 目的基因HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin和內(nèi)參基因GAPDH的PCR引物序列及產(chǎn)物長度Tab．1 The primer sequences and product length of target genes HIF-1α，MT，Slug，E-cadherin and internal control gene GAPDH

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以x±s表示，應(yīng)用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)、Spearman等級相關(guān)分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌組織中的表達(dá) 在69例乳腺癌組織中，HIF-1α陽性表達(dá)率為71．01%(49/69)，在胞漿和胞核均有表達(dá)(如圖1E);MT的陽性表達(dá)率為 42．03%(29/69)，在胞漿和胞核內(nèi)都有表達(dá)(如圖1F);Slug陽性率為43．48%(30/69)，其陽性表達(dá)定位于胞漿和胞核(如圖1G);E-cadherin陽性表達(dá)率為50．72%(35/69)，主要在細(xì)胞膜上表達(dá)(如圖1H)。

由表2可知，HIF-1α、Slug和 E-cadherin的陽性表達(dá)對于TNM分期和腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著性差異(P＜0．05)，而對于年齡、腫瘤大小及病理類型(浸潤性導(dǎo)管癌或浸潤性小葉癌)，均無顯著性差異(P＞0．05)。MT的陽性表達(dá)對于TNM分期具有顯著性差異(P＜0．05)，而對于年齡、腫瘤大小、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型(浸潤性導(dǎo)管癌或浸潤性小葉癌)均無顯著性差異(P＞0．05)。

圖1 乳腺癌組織標(biāo)本中HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin的表達(dá)(SP法，×400)Fig．1 The expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin in breast cancer tissue(SP method，×400)

表2 HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin在乳腺癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系Tab．2 Expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin in breast cancer and its relationship with clinical pathological characteristics of breast caner

2．2 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，在69例乳腺癌組織標(biāo)本中，HIF-1α與MT蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0．285，P ＜0．05)，MT 與 Slug的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0．379，P ＜0．01)，Slug和 E-cadherin的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0．422，P＜0．01)，見表3。

2．3 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-231中的表達(dá) 提取MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法分析在 MCF-7與 MDA-MB-231細(xì)胞中 HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin mRNA的相對表達(dá)水平。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，在MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞中都存在 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin mRNA 的表達(dá)，HIF-1α、MT、Slug mRNA 在惡性程度更高的MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)高于 MCF-7細(xì)胞(P＜0.01)，而E-cadherin mRNA在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)低于MCF-7細(xì)胞(P＜0．01)，如圖2。

表3 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在人乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性Tab．3 Correlation between HIF-1α，MT，Slug andE-cadherin expression in breast cancer tissues

圖2 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin RT-PCR 產(chǎn)物凝膠電泳條帶圖及RT-PCR半定量表達(dá)的比較Fig．2 RT-PCR product gel electrophoresis and semi-quantitative expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin

3 討論

在實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，由于腫瘤的快速生長，腫瘤新生血管供血不足導(dǎo)致局部缺氧，從而誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，被上調(diào)的HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)多種下游基因，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，以逃避或適應(yīng)相對低氧的環(huán)境。HIF-1α在一系列人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且在一些癌前病變組織中HIF-1α也被檢測到存在，提示HIF-1α的表達(dá)可能是腫瘤進(jìn)展中的早期事件。一般認(rèn)為在正常組織中鋅、銅和鎘等金屬離子及一些內(nèi)源性因子能夠誘導(dǎo)MT的合成，但在癌細(xì)胞中MT合成的機(jī)制尚不清楚，有文獻(xiàn)報(bào)道在癌組織中HIF-1α能上調(diào)MT的表達(dá)，MT的生物學(xué)功能不僅在于重金屬解毒，在調(diào)控癌細(xì)胞生長和增殖方面也有重要作用，MT可能是腫瘤進(jìn)展性生物學(xué)行為的一個(gè)標(biāo)志物。近年來轉(zhuǎn)錄因子Slug在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到人們的關(guān)注，在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤中存在明顯上調(diào)［4-6］。一方面，低氧激活HIF-1α可以上調(diào) Slug的表達(dá);另一方面，Slug可以下調(diào)E-cadherin的表達(dá)。E-cadherin是一種重要的阻止腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，人E-cadherin啟動(dòng)子E-box含有5'-CACCTG序列，為含helix-loop-helix(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點(diǎn)，Slug能與此結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［3］。

在本研究的69例乳腺癌組織中，HIF-1α的表達(dá)與TNM分期及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明乳腺癌組織TNM分期越高，組織細(xì)胞內(nèi)缺氧越嚴(yán)重，且乳腺癌組織中HIF-1α的表達(dá)可能有利于癌轉(zhuǎn)移。Spearman等級相關(guān)分析顯示，HIF-1α與MT的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，說明HIF-1α與MT可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，MT蛋白在多種實(shí)體腫瘤及其黑色素瘤和急性淋巴白血病中表達(dá)增加，有研究顯示，低氧可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞表達(dá)MT，促進(jìn)細(xì)胞增生，siRNAMT可抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增生并誘導(dǎo)凋亡［7］;HIF-1是低氧誘導(dǎo)鼠表達(dá)MT所必需的［8］。這些研究表明腫瘤組織MT過表達(dá)與低氧激活HIF-1有關(guān)，HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)MT的表達(dá)。另一方面，近期研究顯示MT可增加HIF-1α的穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng) HIF-1 的轉(zhuǎn)錄活性［9，10］，兩者表現(xiàn)出相互促進(jìn)作用。在本次研究中，隨著TNM分期的增高M(jìn)T表達(dá)增加，表明MT的表達(dá)可能有利于乳腺癌的發(fā)展。通過對MT及Slug相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)它們在乳腺癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，有研究顯示，MT可與細(xì)胞內(nèi)多種含鋅蛋白和轉(zhuǎn)錄因子在空間上直接相互作用，提供鋅離子調(diào)節(jié)含鋅蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的活性［11］，Slug也是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，最初在背部神經(jīng)管中被發(fā)現(xiàn)，參與神經(jīng)胚的形成與神經(jīng)干的正常發(fā)育［3］，后來發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中低氧能使Slug表達(dá)上調(diào)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。我們推測低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的MT可能與Slug有直接相互作用，提供鋅離子調(diào)節(jié)Slug轉(zhuǎn)錄活性。在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)Slug與E-cadherin的表達(dá)具有顯著的負(fù)相關(guān)。Uchikado等［13］在研究彌散性胃癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)Slug的表達(dá)與E-cadherin下調(diào)相關(guān)，這與本次研究結(jié)果一致。Slug含有可與E-cadherin啟動(dòng)子E-box基序結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合到E-cadherin啟動(dòng)子上抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄，Slug的表達(dá)上調(diào)與上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而E-cadherin在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有抗轉(zhuǎn)移功能，癌細(xì)胞可以通過多種機(jī)制抑制E-cadherin的表達(dá)，使癌細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，在間質(zhì)樣浸潤性癌和浸潤性乳腺癌等侵襲性腫瘤中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)有利于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［14，15］。在本研究中的69例乳腺癌組織中，Slug與E-cadherin的表達(dá)均與TNM分期和腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明Slug與E-cadherin表達(dá)可能有利于乳腺癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。通過RT-PCR 發(fā)現(xiàn)，HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞中均有表達(dá)，且在惡性程度更高的MDA-MB-231細(xì)胞中，HIF-1α、MT、Slug mRNA表達(dá)更高，E-cadherin mRNA表達(dá)更低，差異具有顯著性(P ＜0．05)。表明 HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin的表達(dá)情況與乳腺癌的發(fā)展有一定關(guān)系，HIF-1α、MT、Slug的高表達(dá)與 E-cadherin的低表達(dá)有利于腫瘤惡性程度的增加，這與免疫組化的結(jié)果一致。

通過本次研究及相關(guān)文獻(xiàn)，我們推測:在乳腺癌中腫瘤低氧微環(huán)境可以激活HIF-1。一方面，HIF-1可以上調(diào)MT的表達(dá);另一方面，MT可以增加HIF-1α的穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。被上調(diào)的MT可能與Slug有空間上的直接相互作用，提供鋅離子給Slug并增強(qiáng)其活性，Slug作為轉(zhuǎn)錄抑制因子與E-cadherin啟動(dòng)子的E-box結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，但具體的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。由于HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在乳腺癌中的表達(dá)相關(guān)性及其與臨床病理特征的密切關(guān)系，可初步認(rèn)為HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在乳腺癌中的表達(dá)情況可以作為監(jiān)測乳腺癌發(fā)展的指標(biāo)。

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