法桐花粉主要過敏原基因Pla a1重組表達及鑒定①

王貴佐 陶愛林 孫秀珍 李滿祥 劉 昀 鄒澤紅 吳媛媛

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸病研究室，西安710004)

法國梧桐為懸鈴木科、懸鈴木屬，在各地廣泛種植。Kosisky等［1］在1998～2007采用定量收集法對華盛頓市區(qū)進行了10年的氣傳花粉變應(yīng)原調(diào)查，結(jié)果顯示主要的花粉類型包括:櫟樹、柏樹、松科、桑屬、樺科、槭屬、懸鈴木屬、梣屬、禾本科，全年花粉總量中樹花粉所占比例為91．2%，草類占7%。Aira等［2］對西班牙西北部Iberian Peninsula地區(qū)的主要綠化植物進行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)懸鈴木屬、齊墩果屬是當(dāng)?shù)刈钪饕幕ǚ蹃碓础ure等［3］報道了土耳其Bilecik地區(qū)氣傳花粉的研究，發(fā)現(xiàn)松屬、柏科、懸鈴木屬、櫟屬、柳屬是該地區(qū)的主要氣傳花粉，并且空氣中花粉濃度最高在5月。Celenk等［4］在土耳其西北部的Bursa地區(qū)進行了氣傳花粉調(diào)查，發(fā)現(xiàn)松屬、齊墩果屬、懸鈴木屬、柏屬、櫟屬、禾本科、蕁麻科、栗屬在空氣花粉的播散中起主要作用，5月空氣中花粉的濃度達到最高。法桐花粉不僅顯示了較高的空氣飄逸濃度，并且各地研究者發(fā)現(xiàn)法桐花粉可引起廣泛的變態(tài)反應(yīng)。劉光輝等［5］通過對湖北省氣傳花粉的調(diào)查并對2 300例花粉癥患者進行皮膚過敏原檢測試驗及對發(fā)病季節(jié)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，湖北省陽性率最高的春季致敏花粉主要為懸鈴木屬，秋季致敏花粉主要為篙屬、豚草屬。盧家美等［6］通過對花粉的曝片采集及對168名過敏性哮喘患者進行花粉血液變應(yīng)原篩查，得出艾蒿、法桐、藜草、葎草、禾本科可能是西安市的主要致敏花粉。Lauer等［7］發(fā)現(xiàn)在地中海地區(qū)法桐花粉變應(yīng)原IgE反應(yīng)率27．3% ～63．8%，是該地區(qū)的主要氣傳花粉變應(yīng)原。越來越多的調(diào)查資料及臨床流行病學(xué)資料表明，法國梧桐花粉是我國及西方多數(shù)國家地區(qū)花粉癥的重要原因。

目前發(fā)現(xiàn)法桐變應(yīng)原提取液中主要有以下主要致敏蛋白:Pla a1、Pla a2、Pla a3。Pla a1蛋白可與92%以上的法桐花粉癥患者血清發(fā)生反應(yīng)，而Pla a2、Pla a3 反應(yīng)率分別為 84% 和 63．8%［7-9］。目前對法國梧桐花粉主要變應(yīng)原的表達、純化卻鮮有研究，并且對Pla a1蛋白進行表達純化具有很主要的現(xiàn)實意義。本研究對Pla a1蛋白首次進行了表達、純化和鑒定，為制備高純度變應(yīng)原、重組低致敏過敏原及變應(yīng)原核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 試驗試劑:T4 DNA連接酶、pET-44a表達載體購自 Promega公司;宿主大腸桿菌JM109、表達宿主大腸桿菌Rosetta購自Novagen公司;DNA合成和測序由上海博尚生物公司完成;rTaq 聚合酶、10 ×PCR buffer、dNTP Mixture、IPTG 及DL2000 DNA marker等購自大連寶生物工程公司;瓊脂糖、蛋白胨、酵母以及SYBR Green熒光染料等購自基因公司;PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購自QIAGEN公司;PVDF膜購于Millipore公司;預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Bio-Rad公司;脫脂奶粉購自Sigma公司;StrepTrapTMHP 1 ml柱子購自 GE公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 密碼子優(yōu)化及引物設(shè)計 根據(jù)其在Gen-Bank中的ID號AJ427413．2獲得其核苷酸和氨基酸序列，確定開放閱讀框為156個氨基酸，468堿基對，引入NdeⅠ、PstⅠ、XhoⅠ酶切位點及 Strep TagⅡ。根據(jù)原核表達載體大腸桿菌對密碼子的偏愛性，同時考慮RNA的二級結(jié)構(gòu)，提高翻譯起始效率，利用DNAStar軟件進行密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化完成后GC含量由44．3%變?yōu)?7．6%。優(yōu)化后的全基因序列由上海博尚生物有限公司合成。

1．2．2 Pla a1基因表達載體的構(gòu)建 Pla a1基因優(yōu)化后的全編碼區(qū)序列設(shè)計一對引物。引物由上海博尚生物有限公司合成。上游引物為5'-CT-，下游引物 5'-GCCTGCAGAGCACCAAGCAGTTT-3'，上下游引物退火溫度分別為:68．2℃和69．1℃，黑體下劃線部分分別為NdeⅠ、PstⅠ酶切位點。PCR擴增程序為95℃預(yù)變性5分鐘;95℃變性30秒，63．3℃退火30秒(1℃/touchdown/cycle)，72℃延伸30秒，7個循環(huán);95℃變性30秒，57．3℃退火30秒，72℃延伸30秒25個循環(huán);72℃延伸5分鐘。對基因公司合成后甘油菌TOP10-Puc57-Pla a1行單克隆菌落PCR，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCR結(jié)果。對鑒定陽性單克隆菌落搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，NdeⅠ和PstⅠ雙酶切，同時對改造過的pET44a質(zhì)粒載體(載體上含有Strep TagⅡ)NdeⅠ和PstⅠ雙酶切位點，獲得相同粘性末端，2%的瓊脂糖凝膠電泳分別進行目的片段Pla a1及載體pET-44a回收;并進行連接反應(yīng)，目的片段與載體之比為3，T4 DNA連接酶于4℃連接16小時，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET44a-Pla a1;將連接產(chǎn)物經(jīng)KCM(0．5 mol/L KCl，0．15 mol/L CaCl2，0．25 mol/L MgCl2)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)JM109;通過氨芐青霉素Amp抗性LB平板篩選，菌落PCR鑒定陽性克隆，并將陽性單克隆過夜培養(yǎng)菌液送上海博尚生物有限公司測序;選取測序正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化高效表達菌株感受態(tài)Rosetta，氨芐青霉素Amp抗性LB平板篩選，菌落PCR鑒定陽性克隆，并將陽性單克隆過夜培養(yǎng)菌液送測序，選取測序正確的單克隆菌落誘導(dǎo)蛋白表達。

1．2．3 Pla a1蛋白表達及鑒定 挑取測序陽性重組質(zhì)粒pET44a-Pla a1的E．coli Rosetta分別接種至含有Amp(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl)中，37℃振蕩培養(yǎng)12小時后按1%的接種量接種到新鮮的含Amp(50 mg/L)、含葡萄糖(4%)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600在0．6～0．7之間。然后加入終濃度為0．5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，于37℃誘導(dǎo)表達4小時。收集菌體，并進行Pla a1表達蛋白的SDSPAGE。電泳方法參照文獻［10］進行。取1．5 ml菌液離心收集菌體，加入100 μl 2×上樣緩沖液(20 g/L SDS、500 ml/L 甘油、62．5 mmol/L Tris-HCl(pH6．8)、20 ml/L β-巰基乙醇、0．1 g/L 溴酚藍、30 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA)充分混合，煮沸5分鐘后，12 000 r/min離心SDS-PAGE電泳檢測。

1．2．4 鑒定蛋白表達形式 安裝上述方法誘導(dǎo)蛋白表達;4℃、10 000 r/min、6分鐘收集菌液，按菌體濕重為5ml/1g加結(jié)合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8)充分重懸菌液。冰水浴中超聲裂解，裂解5秒停5秒，強度50%，100 W，裂解10分鐘;4℃，12 000 r/min，30分鐘離心分別收集上清1和沉淀;對上述沉淀再次用相同體積的結(jié)合緩沖液重懸洗劑，4℃，12 000 r/min，30分鐘離心再次收集沉淀;對沉淀加入相同體積含6 mmol/L尿素結(jié)合緩沖液(100mmol/L Tris-HCl， 150mmol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA，pH8．0)，重懸沉淀，4℃搖床裂解過夜;4℃，18 000 r/min，30分鐘離心收集上清2;SDS-PAGE鑒定表達蛋白是否為包涵體形式。

1．2．5 Pla a1表達蛋白的純化 將變性后蛋白分別在含4 mol/L尿素、2 mol/L尿素、1 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液各透析12小時。透析后的液體經(jīng)4℃，18 000 r/min，10分鐘收集上清3，準(zhǔn)備過柱純化誘導(dǎo)表達的蛋白。購買于GE公司的Strep Trap HP 1 ml預(yù)裝柱與AKTA FPLC連接并首先用結(jié)合緩沖液按1 ml/min流速平衡柱子，至紫外基線平穩(wěn);將上清3上樣過柱，并用結(jié)合緩沖液洗柱。并收集穿透峰，用洗脫緩沖液洗柱(2．5 mmol/L脫硫生物素100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8．0)并收集洗脫峰。SDS-PAGE蛋白電泳鑒定洗脫峰及穿透峰。

1．2．6 純化蛋白Western blot鑒定分析 純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的PBST緩沖液 (8 g/L NaCl 0．28 g/L KCl 0．28 g/L KH2PO4，2．98 g/L Na2HPO4·12H2O，pH7．4;1 ml/L Tween 20)室溫封閉2小時后，加入法桐花粉過敏患者血清(一抗1∶1稀釋)，4℃三維搖床過夜孵育;用PBST在室溫下三圍搖床上洗4次，每次5分鐘;再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgE抗體(1∶500)，室溫孵育1小時，用PBST在室溫下三圍搖床上洗2次，每次5分鐘;再用PBS洗2次，5分鐘;用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色液顯色10分鐘，檢測Pla a1的抗原性。

1．2．7 純化后的表達蛋白送測序 SDS-PAGE蛋白電泳后，剪取合適大小的PVDF膜，在橫流45 mA室溫條件下進行電印跡轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時間為28分鐘。轉(zhuǎn)印結(jié)束，考馬斯亮藍染色(0．1%考馬斯亮藍R-250溶于40%甲醇/1%乙酸)染色30秒，用脫色液(1%醋酸+50%甲醇脫色)，脫色后用去離子水充分洗滌，然后剪下待測序的條帶，封存在1．5 ml的離心管中送中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化與細胞研究所蛋白質(zhì)組研究分析中心測序。

2 結(jié)果

2．1 重組表達載體的鑒定 重組載體構(gòu)建成功后以T7啟動子開始，在NdeⅠ和PstⅠ酶切位點之間為目的片段，PstⅠ酶切位點之后為8個氨基酸的Strep TagⅡ、雙終止密碼子TAATAA及XhoⅠ酶切位點。PET44a-Pla a1重組子轉(zhuǎn)入JM109，對規(guī)整化后的菌落進行菌落PCR，結(jié)果如圖1。1～9為目的片段，菌落PCR目的片段在500 bp左右，符合目標(biāo)片段大小。質(zhì)粒測序的結(jié)果與原始序列同源性為100%，可以進行下一步原核表達菌株構(gòu)建。

2．2 Pla a1蛋白表達及鑒定 圖2所示，Pla a1在表達菌株Rosetta中的誘導(dǎo)表達，2～4在IPTG濃度為0．5 mmol/L誘導(dǎo)下的表達情況，1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對照樣品。在對照和誘導(dǎo)間(18 kD處)出現(xiàn)明顯差別，表明外源基因進行了Pla a1蛋白表達。采用的marker為03-04蛋白marker。

2．3 鑒定蛋白表達形式 在進行蛋白誘導(dǎo)后的收菌，加非變性裂解液，進行超聲裂解，裂解后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳。如圖3:1為對照，2為誘導(dǎo)，3為超聲裂解后上清，4為超聲裂解后沉淀。由此可見目的蛋白主要包涵體表達。

圖1 JM109菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig．1 PCR amplification of the Pla a1 gene

2．4 Pla a1融合蛋白的純化 利用AKTA FPLC將經(jīng)過StrepTrap HP 1 ml預(yù)裝柱所收集的液體分別取100 μl加入20 μl 6 × loading buffer(內(nèi)含 β-巰基乙醇)煮沸6分鐘后，離心(10 000 r/min，5分鐘)后取其上清10 μl跑SDS-PAGE膠，如圖4:1為穿透峰;2為目的蛋白洗脫峰。1泳帶為上樣后穿透峰所收集的液體，2泳帶為蛋白洗脫時紫外吸收峰大于50 mA時所收集的液體。

圖2 Pla a1基因誘導(dǎo)表達的鑒定Fig．2 Protein expression of Pla a1 gene

圖3 重組蛋白表達形式鑒定Fig．3 Identification of inclusion body protein

圖4 重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳鑒定Fig．4 Identification of the purified recombinant protein by SDS-PAGE

2．5 純化蛋白Western blot鑒定分析 將誘導(dǎo)純化后蛋白利用法桐花粉過敏患者血清進行免疫印跡鑒定如圖5，泳道1為正常血清對照;2～6所用患者血清均經(jīng)過ImmunoCAP檢測，并且血清中法桐花粉變應(yīng)原特異性IgE抗體均在二級以上。從圖5中可以看到在第2～6泳道內(nèi)目標(biāo)大小處有一條清楚的顯色條帶，表明此目的蛋白具有一定抗原性。

圖5 重組Pla a1蛋白的Western blot鑒定Fig．5 Identification of the Pla a1 protein by Western blot

圖6 重組蛋白測序結(jié)果Fig．6 Result of N-terminal amino acid sequence of protein Pla a1

2．6 純化后的融合蛋白送測序 純化后的融合蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜后送中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化與細胞研究所蛋白質(zhì)組研究分析中心測序。蛋白質(zhì)N-端1～6個氨基酸序列測序圖譜如圖6。

3 討論

大量的花粉流行病學(xué)調(diào)查資料顯示我國以及歐美國家法桐花粉飄逸廣泛［1，2，4，11］，更多的文獻指出法桐花粉已經(jīng)引起相關(guān)花粉癥大量出現(xiàn)，如過敏性哮喘、過敏性鼻炎、蕁麻疹等［7，9，12-15］。但是對法桐花粉主要變應(yīng)原鮮有研究，本文對法桐花粉主要變應(yīng)原進行了表達、純化及免疫印記鑒定。

大量研究表明，影響外源基因表達效率的重要因素為密碼子偏愛性、mRNA穩(wěn)定性、翻譯起始效率和載體選擇等［16］。密碼子的偏愛性研究在近年來成為熱點，如果目的基因的密碼子與表達宿主不匹配，則會降低mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性，甚至?xí)斐蒻RNA翻譯的提前終止［17］。本課題通過密碼子優(yōu)化使GC含量由44．3%變?yōu)?7．6%，在翻譯起始區(qū)盡量選用最優(yōu)密碼子，并且充分考慮RNA的二級結(jié)構(gòu)，使起始翻譯區(qū)處于線性開放結(jié)構(gòu)，這樣使蛋白質(zhì)翻譯更容易進行。

本課題收集法桐花粉變應(yīng)原皮試過敏患者血清18例，利用ImmunoCAP檢測，9名患者血清法桐花粉變應(yīng)原特異性IgE抗體檢測均在二級以上，利用純化后的外源目的蛋白與這9名法桐花粉過敏血清進行免疫印記實驗，結(jié)果顯示有5例發(fā)生陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)率超過50%，經(jīng)免疫印跡鑒定為法桐花粉主要變應(yīng)原蛋白，并且證明該外源重組蛋白具有相應(yīng)的抗原性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程制備重組花粉主要變應(yīng)原用于變態(tài)反應(yīng)性疾病的臨床診療和研究已成為變態(tài)反應(yīng)學(xué)科的發(fā)展方向之一。重組變應(yīng)原具有純度高、產(chǎn)量高、易于標(biāo)準(zhǔn)化、無外源性毒性物質(zhì)和病原微生物污染的優(yōu)勢。體外試驗及皮膚試驗的結(jié)果均表明，大部分基因重組變應(yīng)原的變應(yīng)原活性與天然變應(yīng)原相當(dāng)［18］。構(gòu)建含有變應(yīng)原編碼基因的重組質(zhì)粒，表達出有功能活性的重組變應(yīng)原是臨床診斷和治療過敏性疾病的需要，也將為深入研究變應(yīng)原分子結(jié)構(gòu)和致病機制提供材料。本課題工作為后續(xù)低致敏過敏原的改造及變應(yīng)原核酸疫苗的獲得奠定基礎(chǔ)。

致謝:本實驗在廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，呼吸疾病國家重點實驗室，變態(tài)反應(yīng)研究室，過敏反應(yīng)與臨床免疫重點研究室完成，感謝實驗室老師、同學(xué)對我的幫助、支持。

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