肖永平 郭 彬 凌英蓉
(廣東省深圳市中醫(yī)院藥劑科,廣東 深圳 518033)
2型糖尿病占糖尿病絕大多數(shù),主要表現(xiàn)為胰島素抵抗。改善胰島素敏感性已成為2型糖尿病治療的關(guān)鍵[1]。目前提高胰島素敏感性的藥物主要為噻唑烷二酮類,但其副作用較大[2]。第一代噻唑烷二酮類如曲格列酮因肝臟毒性而退市,2010年10月,歐洲市場因羅格列酮的心臟毒性而宣布退市。中藥盡管直接降糖作用微弱,但副作用較小,在防治并發(fā)癥及改善胰島素敏感性方面可能具有一定的優(yōu)勢[3]。滋腎降糖丸為臨床作用應(yīng)用多年的經(jīng)典中藥復(fù)方,主要成分由黃芪、黨參、龜甲、三七、地黃、熟地、五味子、黃精、牛膝、牡蠣、骨碎粉等組成,主要功效為益氣養(yǎng)陰、調(diào)節(jié)血糖,滋腎壯骨[4,5]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方可調(diào)節(jié)血糖,但具體機(jī)制不是很清楚。本研究主要通過高脂飼喂的小鼠模型制作胰島素抵抗的模型,探討了滋腎降糖丸對胰島素敏感性的影響及其相關(guān)機(jī)制,從而為臨床相關(guān)用藥奠定理論基礎(chǔ)。
3周齡的C57BL/6J小鼠[SPF級, 合格證號SCXK(滬) 2007-0005]購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)在清潔級動(dòng)物房(溫度:(20±2)℃,濕度:(60±5)%,12h/12h晝夜交替光照)。動(dòng)物自由攝食。普通和高脂食物購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。普通食物含20.5%粗蛋白,4.62%粗脂肪,52.5%無氮提取物,4.35%粗纖維(總卡路里3.45 Kcal/g,12%卡路里為脂肪)。高脂食物含有18.8 %粗蛋白,16.2%粗脂肪,45.2%無氮提取物,3.98% 粗纖維(總卡路里3.79 Kcal/g,38%的卡路里為脂肪)。
表1 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4( Glut4)和GAPDH引物設(shè)計(jì)
表2 Changes of blood glucose,triglycerides,total cholesterol,insulin levels,and insulin index in high-fat fed mice after 4 weeks of treatment of ZSJT.
選取剛斷乳的C57BL/6J雄性小鼠(12g左右)。實(shí)驗(yàn)分為5組:正常飼料組,高脂模型組,高脂模型加滋腎降糖丸(深圳中醫(yī)院藥劑科制備)大(400mg/kg/d)、小劑量組(200 mg/kg/d),高脂模型加非諾貝特組(200 mg/kg/d)。每組10只C57BL/6小鼠。測試藥用雙蒸水溶解,均按0.2ml/10g灌胃給藥,連續(xù)給藥4組,對照組服用相應(yīng)體積的雙蒸水。實(shí)驗(yàn)期間每周定期監(jiān)測體重,食物攝取量。實(shí)驗(yàn)后取血檢測血糖,血脂和胰島素水平,實(shí)驗(yàn)前禁食6h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剝離小鼠后肢肌肉組織,液氮瞬時(shí)冷凍后,儲存于-80℃冰箱備用。血糖、總膽固醇、甘油三酯用商業(yè)試劑盒進(jìn)行檢測 (北京中生北控股份有限公司)。血胰島素用ABC-ELISA試劑盒 (上海西唐生物科技有限公司)。胰島素敏感性指數(shù)計(jì)算為1/(空腹血糖×血胰島素),其值越大,敏感性越高。
隨機(jī)取新鮮準(zhǔn)備的肌肉組織(n=6),總RNA用Trizol試劑提取。用大連寶生物工程有限公司TaKaRa的SYBR? Premix Ex Taq? II(TaKaRa Code:DRR081)試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)。檢測在7500 Real Time PCR 系統(tǒng) (Applied Biosystems,美國)。程序設(shè)置為95℃×30sec,接著95℃×5 sec,60℃×34sec進(jìn)行40個(gè)循環(huán),GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。所有的樣品測試三次。 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(Glut4)和GAPDH引物設(shè)計(jì)如下為(表1)。
數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,組間采用單因素方差分析(ANOVA),之后用Newman–Keuls比較檢測其顯著性,P<0.05視為具有顯著性差別。
2.1 滋腎降糖丸對血糖、血脂、胰島素、胰島素敏感指數(shù)的影響高脂小鼠血糖、血膽固醇、血胰島素水平出現(xiàn)顯著升高,而胰島素敏感指數(shù)顯著降低(表2)。滋腎降糖丸大劑量顯著抑制血糖、血膽固醇和胰島素水平的增加,同時(shí)顯著增加胰島素敏感性指數(shù)。滋腎降糖丸小劑量組作用較弱。陽性藥物非諾貝特作用較強(qiáng),顯著抑制血糖、血膽固醇和胰島素水平的增加,同時(shí)顯著增加胰島素敏感性指數(shù)。
2.2 滋腎降糖丸對肌肉Glut4基因表達(dá)的影響
和正常小鼠比較,高脂小鼠肌肉Glut4 mRNA的表達(dá)顯著降低,但滋腎降糖丸大、小劑量均顯著增加Glut4 mRNA的表達(dá),且有一定劑量依賴關(guān)系。非諾貝特作用更強(qiáng)。見圖1。
圖1 Expression of Glut4 mRNA in muscles of high-fat fed mice after 4 weeks of treatment of ZSJT. aaP<0.01 vs Normal; bbP<0.01 ZSJT vs HFD; ccP<0.01 Fenofibrate vs Normal. Normal,normal control mice; HFD,high-fat diet-fed control mice; ZSJT-400,Zhi-Shen-Jiang-Tang Pill(400mg/kg)-treated high-fat diet-fed mice; ZSJT-200,Zhi-Shen-Jiang-Tang Pill(200mg/kg)-treated high-fat diet-fed mice.
高脂小鼠通過一定時(shí)間飼喂后,將表現(xiàn)出胰島素抵抗的現(xiàn)象,是糖脂代謝紊亂的關(guān)鍵。改善胰島素敏感性是該疾病治療的關(guān)鍵。滋腎降糖丸為深圳市中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的中藥復(fù)方制劑,臨床研究發(fā)現(xiàn),該藥具有調(diào)節(jié)血糖的作用,然而具體的機(jī)制不是很清楚。本研究中我們發(fā)現(xiàn)滋腎降糖丸適度控制血糖水平,盡管作用較弱,但顯著改善胰島素敏感性指數(shù),降低體內(nèi)胰島素水平。Glut4是轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵因子,其表達(dá)增加將有可能增加葡萄糖的攝取,改善胰島素敏感性[6]。該研究表明滋腎降糖丸顯著增加Glut4的基因表達(dá)的作用,因而我們推測滋腎降糖丸改善胰島素敏感性的作用可能與此有關(guān)。盡管滋腎降糖丸作用較陽性藥物為弱,但副作用較小,因此在輔助治療方面仍將具有一定的應(yīng)用前景。特別指出2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征都有胰島素抵抗的特征,因此滋腎降糖丸在這一類疾病中可能具有廣泛的用途。
滋腎降糖丸具有改善胰島素敏感性的作用,其機(jī)制可能與上調(diào)肌肉組織中Glut4的表達(dá)有關(guān)。
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