郭慶寅 伍學(xué)強(qiáng) 劉玉峰

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，河南 鄭州450000；2.北京航天總醫(yī)院血液腫瘤研究所，北京 100076

急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)以特異的染色體易位t(15；17)(q22；q21)為特征，形成PML-RARα融合基因，表達(dá)PML-RARα融合蛋白，引起RARα轉(zhuǎn)錄活化功能障礙，使粒細(xì)胞分化阻滯于早幼粒細(xì)胞階段［1］。本研究采用NB4細(xì)胞株作為體外細(xì)胞模型，通過對(duì)丹參酮ⅡA(TanⅡA)與全反式維甲酸(all-tram retinoid，ATRA)及三氧化二砷(As2O3)誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化在細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)、免疫表型和對(duì)PML-RARαmRNA和PML-RARα融合蛋白影響的比較，探索TanⅡA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將NB4細(xì)胞(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院血液學(xué)研究所提供)加入含10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞，分別加入濃度為1.70、2.55及3.40 μmol/L的TanⅡA(中國藥品生物制品檢定所化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品)，同時(shí)加入濃度為0.1及1.0 μmol/L的As2O3(哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司)、1.0 μmol/L的ATRA(美國Sigma公司)和濃度為0.01%的DMS0。分別檢測(cè)培養(yǎng)12、24、48、72、96、120、144和168 h時(shí)間點(diǎn)的多項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

各時(shí)間段NB4細(xì)胞用錐蟲蘭拒染法在光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)觀察及分化抗原的檢測(cè)

NB4細(xì)胞瑞氏染色后觀察細(xì)胞形態(tài)；加入鼠抗人的PE標(biāo)記的CD11b和FITC標(biāo)記的CD33的抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞分化抗原(CD33、CD11b)表達(dá)。

1.4 細(xì)胞PML-RARαmRN A的檢測(cè)

取4×106個(gè)NB4細(xì)胞，應(yīng)用TRIzol(Life Techologies公司)按說明書抽提總RNA。氯仿相分離，異丙醇沉淀RNA。乙醇洗滌RNA 團(tuán)塊，干燥并溶解RNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取2.5 μL RNA加入反應(yīng)體系，RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)PML-RARα基因的 cDNA，按賽百盛技術(shù)公司(北京SBS Genetech有限公司)硅膠膜型PCR純化試劑盒說明書純化cDNA。引物和探針設(shè)計(jì)參照歐洲抗癌協(xié)作組制訂的方案［2］，cDNA加入20 μL的反應(yīng)體系中(大連寶生物公司)，在Lightcycler2.0型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Roche公司)。

1.5 細(xì)胞 PML-RARα融合蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

用Western blot檢測(cè)PML-RARα融合蛋白。將NB4細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液后，冰上溫育20 min，離心(12 000 r/min×20 min，離心半徑為10 cm)后-80 ℃冰箱凍存。蛋白提取物經(jīng)定量后，取30 μg在的聚丙烯酰胺凝膠上電泳、轉(zhuǎn)膜，3%BSA封閉，分別與抗PML抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗溫育。最后經(jīng)顯色自顯影，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析灰度值和相對(duì)濃度值。

1.6 細(xì)胞內(nèi)PML蛋白觀察

方法［3］，將NB4細(xì)胞離心涂片、固定，0.1%Triton 100破細(xì)胞膜、抗PML抗體(PG-M3)、FITC標(biāo)記的二抗等處理后，觀察PML熒光顆粒的數(shù)量、形態(tài)和大小并相對(duì)量化核小體恢復(fù)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)處理軟件采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s 表示，采用方差分析比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

NB4細(xì)胞生長(zhǎng)受抑程度隨著TanⅡA濃度的增加而增強(qiáng)，低濃度與中高濃度的TanⅡA在48 h后生長(zhǎng)抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.93，P=0.013 6)。同時(shí)TanⅡA對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間依賴性。48 h后2.55 μmol/L TanⅡA組生長(zhǎng)抑制率強(qiáng)于0.10 μmol/L As203組(F=6.30，P=0.036 4)，與1.0 μmol/L As203組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.02，P=0.079 9，表1)。

表1 不同濃度TanⅡ、AAs2O3及ATRA對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率影響的比較Tab.1 Effects of Tan ⅡA , ATRA and As2O3 with different concentration on the growth inhibition of NB4 cell lines(±s, %)

表1 不同濃度TanⅡ、AAs2O3及ATRA對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率影響的比較Tab.1 Effects of Tan ⅡA , ATRA and As2O3 with different concentration on the growth inhibition of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 2.55 μmol/L TanⅡA group ,#: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 1.70 μmol/L TanⅡA group 3 2.2±1.1 3.8±1.5 5.5±2.3# 8.7±2.2# 10.3±2.5# 13.3±3.5# 20.3±4.1# 28.7±3.5#2.55 μmol/L TanⅡA group 3 2.3±1.2 5.6±2.2 12.3±2.1 18.2±3.1 26.4±3.2 32.1±4.6 48.3±5.8 52.4±4.2 3.40 μmol/L TanⅡA group 3 2.1±0.9 8.3±1.7 15.9±3.1 20.5±3.5 28.6±2.0 50.8±41# 52.1±5.6 54.2±4.1 0.10 μmol/L As2O3 group 3 1.0±0.4 3.5±1.3 6.1±1.6# 10.6±2.3# 14.5±2.3# 21.3±2.3# 33.4±3.4# 38.4±3.5#1.0 μmol/L As2O3 group 3 2.1±0.8 6.4±2.1 13.3±2.2 20.1±2.4 27.7±3.2 49.9±4.2# 51.5±5.3 53.4±4.4 1.00 μmol/L ATRA group 3 3.5±1.1 10.3±2.0# 18.3±2.4# 254±3.2# 30.1±3.2 55.3±4.5# 561±4.2# 57.2±3.2

2.2 各組誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)變化

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TanⅡA對(duì)NB4細(xì)胞分化作用逐漸明顯，96～168 h 1.70 μmol/L TanⅡA組與其他兩組桿狀分葉核表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.47，P=0.002 6)，2.55 μmol/L TanⅡA和3.40 μmol/L TanⅡA各時(shí)段差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.13，P=0.348 8)。48～168 h期間，2.55 μmol/L TanⅡA組誘導(dǎo)分化率強(qiáng)于兩組As203組(F=4.86，P=0.049 1，表2)。

2.3 各組誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化抗原表達(dá)

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TanⅡA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞CDllb表達(dá)逐漸增加(表3)，而CD33表達(dá)逐漸下降，1.70 μmol/L TanⅡA組作用差于2.55和3.40 μmol/L TanⅡA組(χ2)；2.55和3.40 μmol/L TanⅡA組各時(shí)點(diǎn)分化抗原表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.94，P=0.447 4) (表4)。

2.4 對(duì)NB4細(xì)胞PML-RARα mRNA的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)融合基因PMLRARαmRNA，顯示3組不同濃度TanⅡA樣本各時(shí)間段Ct值和濃度比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.28，P=0.083 4，表5)。

2.5 對(duì)NB4細(xì)胞PML-RARα融合蛋白的影響

3種不同濃度TanⅡA處理NB4細(xì)胞12 h時(shí)，PML-RARα融合蛋白有減少跡象，可見PML條帶的出現(xiàn)。3組PML的表達(dá)隨濃度增加而增加。ATRA組和兩種不同濃度的As2O3組，在24 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)中均可見PML-RARα融合蛋白減少，PML增加的跡象(表6)。

2.6 各組對(duì)NB4細(xì)胞PML的影響

TanⅡA處理24 h起，細(xì)胞核內(nèi)顆粒均見不同程度的由量多細(xì)小細(xì)胞顆粒，逐漸變?yōu)轭w粒粗大、顆粒數(shù)量較少的粗顆粒。至72 h核內(nèi)顆粒呈大的點(diǎn)狀或斑點(diǎn)狀，顆粒數(shù)量在15～30個(gè)之間，與正常粒細(xì)胞對(duì)照組相似。在各時(shí)間段，3種不同濃度的TanⅡA和其他所有藥物組PML熒光顆粒積分與0.01%DMSO組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.20，P= 0.038 9，圖1)。

表2 TanⅡA與ATRA和As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化率的比較Tab.2 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the morphologic changes of NB4 cell lines(±s, %)

表2 TanⅡA與ATRA和As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化率的比較Tab.2 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the morphologic changes of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 0.01% DMSO group, *: P＜0.05; Compared with 2.55 μmol/L TanⅡA group, #: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 0.01%DMSO group 3 3.4±0.8 3.3±0.9 3.1±0.9 3.2±0.8 5.4±1.3 46±1.2 5.4±1.4 5.6±1.8 2.55 μmol/L TanⅡA group 3 3.7±0.8 9.5±0.8* 20.7±4.4* 39.7±3.1* 64.8±5.8* 88.7±4.1* 88.6±4.8* 89.5±6.8*0.10 μmol/L As2O3 group 3 3.4±0.8 5.4±0.9*# 13.5±57*# 20.5±2.7*# 31.3±3.2*# 45.5±5.7*# 46.4±3.6*# 42.5±4.6*#1.00 μmol/L As2O3 group 3 3.5±0.9 9.4±0.9* 14.5±3.7*# 24.5±2.4*# 29.2±3.1*# 39.5±3.8*# 39.1±4.8*# 50.5±3.9*#1.00 μmol/L ATRA group 3 3.5±0.9 12.5±1.3*# 29.6±4.2*# 50.6±5.2*# 753±6.3*# 911±4.2* 91.3±7.2* 91.8±6.1*

表3 各組誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化抗原CD11b表達(dá)的比較Tab.3 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD11b of NB4 cell lines(±s, %)

表3 各組誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化抗原CD11b表達(dá)的比較Tab.3 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD11b of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 0.01% DMSO group, *: P＜0.05; Compared with 2.55 μmol/L TanⅡA group, #: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 1.70 μmol/L TanⅡA group 3 4.5±2.3 8.6±1.5* 21.2±2.3* 32.8±4.3* 43.4±4.7*# 52.9±4.7*# 55.3±2.7*# 56.1±3.2*#2.55 μmol/L TanⅡA group 3 7.2±2.1* 8.7±1.2* 23.8±2.0* 36.4±3.5* 55.7±4.6* 59.6±5.1* 66.2±5.9* 71.3±6.9*3.40 μmol/L TanⅡA group 3 7.3±2.9* 10.3±1.7* 23.2±2.1* 39.6±3.7* 56.8±5.3* 62.3±7.9* 69.1±5.3* 72.1±5.5*0.10 μmol/L As2O3 group 3 4.8±3.0 5.9±1.4*# 12.8±2.9*# 27.7±2.2*# 28.4±4.6*# 31.0±4.2*# 35.4±1.7*# 34.6±2.1*#1.00 μmol/L As2O3 group 3 4.9±2.6 7.5±1.1* 13.2±3.2*# 45.2±4.7*# 27.4±5.1*# 38.6±4.8*# 37.3±1.6*# 33.2±2.4*#1.00 μmol/L ATRA group 3 10.2±3.2* 17.7±2.8*# 34.3±3.8*# 254±3.2# 59.7±6.2* 65.3±7.6* 69.8±5.6* 72.5±6.9*0.01% DMSO group 3 2.4±1.2 2.5±1.1 2.1±0.8 1.4±1.3 2.2±0.7 1.3±0.8 2.3±1.1 1.4±0.5

表4 各組誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化抗原CD33表達(dá)的比較Tab.4 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD33 of NB4 cell lines(±s, %)

表4 各組誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化抗原CD33表達(dá)的比較Tab.4 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD33 of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 0.01% DMSO group, *: P＜0.05; Compared wiht 2.55μmol/L TanⅡA group , #: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 1.70 μmol/L TanⅡA group 3 93.6±1.1 86.5±3.5* 75.9±5.2* 66.9±6.2* 50.4±5.8*# 42.0±5.4*# 37.3±3.2*# 33.8±3.7*#2.55 μmol/L TanⅡA group 3 94.3±1.2 87.2±4.2* 70.6±6.1* 55.8±7.8* 41.3±5.4* 31.8±4.2* 26.6±3.8* 26.8±3.2*3.40 μmol/L TanⅡA group 3 92.1±0.9 85.1±4.5* 67.9±6.9* 50.7±6.3* 38.6±4.0* 29.7±3.9* 25.9±3.6* 24.6±3.3*0.10 μmol/L As2O3 group 3 93.0±1.4 90.3±4.3 81.2±6.7* 73.4±8.2*# 65.6±7.2*# 58.5±6.7*# 56.8±4.8*# 57.2±5.6*#1.00 μmol/L As2O3 group 3 93.7±0.8 86.6±4.1* 80.5±7.1* 71.1±9.5*# 64.4±7.1*# 60.2±7.7*# 57.7±4.3*# 56.5±6.4*#1.00 μmol/L ATRA group 3 89.5±2.1* 81.4±5.8*# 62.1±6.2*# 53.3±6.1* 39.0±5.2* 35.0±4.1* 24.2±3.3* 22.3±3.5*0.01% DMSO group 3 94.8±1.3 95.3±2.3 95.8±2.6 94.4±1.1 93.6±1.5 94.6±2.3 92.3±2.1 93.7±1.2

3 討 論

近年來，傳統(tǒng)中草藥 治療惡性腫瘤得到了越來越多學(xué)者的認(rèn)可，現(xiàn)已證明中草藥在腫瘤的綜合治療中起重要作用［4］。丹參酮ⅡA是從活血化瘀中藥丹參中提取的有效成份，分子式為C19H1803，其結(jié)構(gòu)中含有醌型結(jié)構(gòu)，易被氧化還原，有多種生物學(xué)活性，可參與機(jī)體的多種生化反應(yīng)，已在心血管、神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，近年來發(fā)現(xiàn)其對(duì)白血病等腫瘤疾病具有抗腫瘤作用［5］。APL是急性髓細(xì)胞白血病的一種特殊類型，是最有希望治愈的急性白血病。APL具有特征性染色體異常t(15;17)(q22;q2l)，導(dǎo)致形成PML-RARα融合基因。PML-RARα融合基因轉(zhuǎn)錄、翻譯PML-RARα融合蛋白，PML-RARα融合蛋白通常與RXR或RARα形成多聚復(fù)合體，該復(fù)合體與RARα競(jìng)爭(zhēng)RARE和RXR，抑制RARα的轉(zhuǎn)錄活性，阻斷粒細(xì)胞的分化成熟，導(dǎo)致APL發(fā)生。同時(shí)PML蛋白從核小體(NBs)中釋放出來，與PMLRARα融合蛋白形成二聚體，使NBs中PML蛋白減少，NBs的結(jié)構(gòu)和功能破壞，免疫熒光染色表現(xiàn)為由大斑點(diǎn)型變?yōu)榧?xì)小顆粒型。NBs為細(xì)胞核內(nèi)一種多蛋白復(fù)合體，PML蛋白形成其外殼，在維持NBs正常結(jié)構(gòu)中起核心作用［6］，PML發(fā)揮抑制生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡作用。PML蛋白和NBs相關(guān)蛋白的異位在APL發(fā)病中發(fā)揮重要作用。因此，恢復(fù)PML正常定位和正常NBs結(jié)構(gòu)是APL新的治療策略。NB4細(xì)胞株來自一例第2次復(fù)發(fā)的APL女性患者，1991年建株。NB4細(xì)胞具有特征性的t( 15; 17)染色體移位，表達(dá)PML－RARα融合蛋白。在體外和動(dòng)物模型中對(duì)誘導(dǎo)分化劑ATRA敏感，是研究APL分化作用機(jī)制的理想模型［7］。

表5 QT-PCR各組樣本CT值比較Tab.5 Effects of Tan ⅡA , ATRA and As203 on the Ct values of expressions of PML-RARα mRNA of NB4 cell lines(x±s, %)

表6 各組24 h PML-RARα融合蛋白融合蛋白表達(dá)的比較Tab.6 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the PML/RARα fusion protein expression of NB4 cell lines for 24 h

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)TanⅡA能明顯抑制NB4細(xì)胞生長(zhǎng)。從形態(tài)學(xué)觀察，TanⅡA能促進(jìn)NB4細(xì)胞分化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，NB4細(xì)胞在TanⅡA的作用下，在粒細(xì)胞早期表達(dá)的CD33表達(dá)逐漸減少，而在成熟粒細(xì)胞高表達(dá)的CDllb表達(dá)逐漸增多，從免疫表型上再一次證實(shí)了TanⅡA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的能力［8］。許多研究證實(shí)TanⅡA能誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞性白血病分化［5,9-10］，但其作用機(jī)制并不明確。

我們的研究證實(shí)，TanⅡA能恢復(fù)PML在NB4細(xì)胞核體定位。抗PML熒光單抗可很好地顯示PML在NB4細(xì)胞中的定位，TanⅡA作用前為散布于細(xì)胞內(nèi)小斑點(diǎn)形的細(xì)顆粒，3種不同濃度的TanⅡA作用后12 h即可見粗顆粒狀PML小體，以后逐漸增加，到72 h NBs結(jié)構(gòu)與數(shù)量即與正常的粒細(xì)胞無異。TanⅡA恢復(fù)核體結(jié)構(gòu)的能力與其濃度有關(guān)，1.70 μmol/L TanⅡA的作用弱于其他兩劑量組，2.55和3.40 μmol/L TanⅡA組作用相似，顯示2.55 μmol/L為最適作用濃度。

通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)不同濃度的TanⅡA處理后的NB4細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，12～168 h NB4細(xì)胞PML-RARα融合基因表達(dá)mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)TanⅡA對(duì)PML-RARα融合基因的表達(dá)無直接作用，不能影響PML-RA Rα融合蛋白的表達(dá)。

在實(shí) 驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，TanⅡA處理NB4細(xì)胞1 2 h時(shí)，可見PML-RARα條帶灰度值下降，PML條帶顯現(xiàn)，表明TanⅡA能降解PMLRARα，使PML-RARα與復(fù)合物解離，解救RARα和PML，恢復(fù)PML功能，促進(jìn)RARα的靶基因的激活，使細(xì)胞分化得以恢復(fù)。經(jīng)過比較可見，TanⅡA降解PML-RARα作用有劑量依賴性，3種不同濃度TanⅡA組PML的條帶灰度值不同，2.55 μmol/L 和3.40 μmol/L TanⅡA組灰度值較高。

從以上實(shí)驗(yàn)，我們可見TanⅡA具有誘導(dǎo)分化APL細(xì)胞的作用，我們也證實(shí)了TanⅡA是通過降解PML-RARα融合基因表達(dá)的蛋白而產(chǎn)生誘導(dǎo)分化作用的。那么TanⅡA是通過什么途徑降解PML-RARα融合蛋白的呢，我們可以從ATRA誘導(dǎo)分化和降解PML-RARα融合蛋白中得到某些啟示。ATRA是通過兩種途徑降解PML-RARα融合蛋白，即半胱天冬酶(caspases)途徑與泛素(ubiquitin)途徑。ATRA誘導(dǎo)Caspase-3樣活性，降解PML-RARα，切割位點(diǎn)位于螺旋盤狀結(jié)構(gòu)的羧基端。前期的研究證實(shí)TanⅡA能激活caspase3［11］，由此我們可以推論：TanⅡA誘導(dǎo)APL分化是通過激活caspases降解PML-RARα融合蛋白，恢復(fù)NBs功能，解除PML-RARα對(duì)RAR a靶基因轉(zhuǎn)錄抑制而實(shí)現(xiàn)的。TanⅡA誘導(dǎo)APL凋亡是否存在泛素途徑作用，是否存在其他途徑，有待進(jìn)一步探討。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)TanⅡA產(chǎn)生誘導(dǎo)分化作用的時(shí)間較ATRA長(zhǎng)，這可能與ATRA作用的位點(diǎn)不同，也可能激活的信號(hào)傳導(dǎo)途徑不同，也可能導(dǎo)致基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化不同，這有待我們進(jìn)一步探討研究。

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