張友才 陳金霞 張偉偉 李驥

溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染內(nèi)科，浙江 溫州 325005

由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)活性改變誘導(dǎo)的DNA甲基化模式改變是腫瘤異常表觀遺傳修飾的重要機(jī)制，主要表現(xiàn)為基因組整體的低甲基化和區(qū)域性高甲基化，通過改變癌基因、抑癌基因的表達(dá)和基因組的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)正常細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)變［1-2］。DNMT3基因是DNMT家系重要成員，在建立組織特異性甲基化模式方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)為公認(rèn)的原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)致癌因素之一，其致癌過程中同樣涉及DNA甲基化模式異常改變［3-6］。DNMT3在肝細(xì)胞癌變過程中動(dòng)態(tài)變化的研究少見報(bào)道，本研究旨在分析AFB1誘導(dǎo)性大鼠肝細(xì)胞癌變不同階段DNMT3a mRNA和DNMT3b mRNA變化特征，初步研究AFB1誘導(dǎo)性大鼠HCC發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1 材料

4周齡清潔級近交系雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量60～80 g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。AFB1購自美國Sigma公司(批號A6636)，二甲基亞砜(DMSO)和2-乙酰氨基芴(2-AAF)購自廣州偉伯化工有限公司(編號226388、304-28-9)，2-AFF飼料為將基本飼料粉碎后，按150 g∶1 000 g充分混合而成。總RNA提取(TaKaRa RNAiso Plus)、cDNA合成及RT-PCR擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa RNA PCR Kit ver 3.0)購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)分組：40只大鼠按隨機(jī)區(qū)域分組法分為正常對照組(12只)和誘癌組(28只)。按清潔級動(dòng)物要求養(yǎng)在溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度控制在(24±1)℃，相對濕度45%～70%。水和飼料任大鼠自由飲食。模型制作［7］：基本飼料喂養(yǎng)1周后，大鼠腹腔注射AFB1(400 μg/kg，AFB1用15 mL DMSO溶劑混勻)，每周6次，持續(xù)2周；2-AFF飼料喂養(yǎng)2周后，重復(fù)上述制作過程。8周后用基本飼料喂養(yǎng)，于37周時(shí)停藥，基本飼料喂養(yǎng)至53周。于實(shí)驗(yàn)第25周、37周時(shí)隨機(jī)取對照組大鼠4只，誘癌組大鼠6只，斷頸處死，53周處死所有大鼠。對照組飼以基本飼料。模型制作過程中任大鼠自由飲水。

1.3 病理觀察

透射電鏡組織超微病理觀察，將所取新鮮肝組織切成1 mm3大小，用2.5%戊二醛固定，PBS漂洗后，1%鋨酸固定，制成2 μm超薄切片，用醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙重染色，使用日本日立公司H-7500型透射電鏡觀察。

1.4 RT-PCR檢測DNMT3a mRNA及DNMT 3b mRNA的表達(dá)

用RNAiso Plus試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測吸光度(D)值，以D260/D280=1.8～2.0為RNA質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)。按試劑盒說明書要求合成cDNA。DNMT3a上游引物：5’-GGCCTTATGGGCTGAGAAGA-3’，下游引物：5’-CTCATACTCGGGCTCGTCAT-3’；DNMT3b上游引物：5’-TGAAGGGAGACAGCAGACAT-3’，下游引物：5’-GCGGCCTCTGGTCTCTGGTG-3’；GAPDH上游引物5’-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3’，下游引物5’-CACCAGTGGATGCAGGGAT-3’；產(chǎn)物長度分別為226、176和477 bp。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s(擴(kuò)增DNMT3b時(shí)為54 ℃)，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次后，72 ℃終延伸5 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在凝膠成像系統(tǒng)(Biosens Sc 810)分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝組織病理及超微病理改變

誘癌組大鼠25周時(shí)肝細(xì)胞以變性、壞死損傷病變?yōu)橹?。電鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞脂肪變性腫脹，小葉內(nèi)可見灶性壞死伴炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核稍增大，細(xì)胞質(zhì)淡染，未見腫瘤發(fā)生。37周時(shí)5只大鼠肝表面可見微小顆粒。電鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)破壞, 可見灶狀增生性空泡變性或透明變性小肝細(xì)胞，核圓形，深染或多核，可見病理性核分裂相。異形肝細(xì)胞構(gòu)成增生結(jié)節(jié)，匯管區(qū)內(nèi)可見卵圓細(xì)胞、結(jié)締組織增生。另1只大鼠肝組織未見腫瘤細(xì)胞(以損傷病變?yōu)橹?。47周死亡大鼠2只，49周時(shí)有3只大鼠死亡，死亡率為17.86%。53周時(shí)，10只大鼠肝表面可見大小不一結(jié)節(jié)。光鏡下：細(xì)胞形態(tài)大小不一致，細(xì)胞核深染，體積增大，可見巨核、多核及多形核，核質(zhì)比增大，癌細(xì)胞排列為粱狀、腺狀、實(shí)片狀，肝細(xì)胞增生灶和結(jié)節(jié)較多。2只大鼠肝癌組織中觀察到肝細(xì)胞吞噬細(xì)胞現(xiàn)象，1只大鼠無腫瘤發(fā)生(為損傷病變)。

對照組25周時(shí)透射電鏡下大鼠肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，核質(zhì)比正常，細(xì)胞核位于中央，呈圓形或卵圓形，染色質(zhì)淺淡，細(xì)胞器分布均勻。誘癌組大鼠多數(shù)肝細(xì)胞形態(tài)尚規(guī)則，呈圓形，肝細(xì)胞核仁稍增大，核質(zhì)比基本正常，核內(nèi)異染色質(zhì)較豐富，呈細(xì)顆粒狀彌漫分布。少數(shù)肝細(xì)胞異染色質(zhì)色深，呈核膜邊集，線粒體輕度腫脹、增生，粗、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、擴(kuò)張，糖原顆粒多見。37周時(shí)電鏡下肝細(xì)胞腫脹明顯，核體積增大，核膜固縮，異染色質(zhì)在核膜下聚集，核仁深染。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)目增多，腫脹，嵴變短，減少，基質(zhì)密度增加，呈粗顆粒狀。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，呈囊性擴(kuò)張或裂成泡狀。部分肝細(xì)胞線管狀滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生。糖原顆?？梢?。53周時(shí)電鏡下瘤細(xì)胞大小不一致。細(xì)胞核深染、大小不均。核膜曲折內(nèi)陷或外凸，異染色質(zhì)豐富，呈粗顆粒狀彌漫分布或凝集成塊堆集在核膜下?？梢娋藓?、雙核，甚至多核。細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)整，可見怪異核。核仁體積增大，數(shù)目增多，形態(tài)不規(guī)則，靠邊。線粒體明顯增生、腫脹，濃淡不一，多數(shù)肝細(xì)胞數(shù)目減少，基質(zhì)變淡透亮，甚至基質(zhì)顆粒消失，呈空泡狀。部分肝細(xì)胞可見線管狀滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生。糖原顆粒偶見。肝細(xì)胞間纖維結(jié)締組織增生明顯?？梢娏馨图?xì)胞浸入肝細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見吞噬細(xì)胞溶解物堆集?？梢姼渭?xì)胞吞噬細(xì)胞現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)大塊致密物沉積，細(xì)胞核固縮、濃集(圖1)。

2.2 肝組織中DNMT3a mRNA、3b mRNA表達(dá)水平

圖1 正常肝組織和不同時(shí)期肝損傷透射電鏡圖Fig.1 Normal liver tissue and injured liver tissues in different stage by transmission electron microscope

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，DNMT3a mRNA、3b mRNA在兩組大鼠肝組織中均有表達(dá)，其相對分子質(zhì)量分別為226 bp和176 bp(圖2、3)。DNMT3a mRNA、3b mRNA在癌腫組織中表達(dá)水平均顯著高于其他各組大鼠肝組織(F=23.95，P=0.000；后者F=15.07，P=0.000)。對照組大鼠肝組織中DNMT3a mRNA表達(dá)水平明顯低于損傷病變、早期癌變肝組織(t=10.37，P=0.000；后者t=6.60，P=0.000)，而大鼠損傷病變、早期癌變肝組織間其表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.59，P=0.58)。DNMT3b mRNA在早期癌變肝組織中的表達(dá)水平均明顯高于大鼠損傷病變、對照組大鼠肝組織(t=3.51，P=0.006；后者t=3.18，P=0.013)，而在對照組大鼠肝組織與大鼠損傷病變肝組織間其表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.35，P=0.22，表1)。

圖2 DNMT3a mRNA表達(dá)產(chǎn)物的2%瓊脂糖電泳圖譜Fig.2 DNMT3a mRNA expression products by 2%agarose gel electrophoresis

圖3 DNMT3b mRNA表達(dá)產(chǎn)物的2%瓊脂糖電泳圖譜Fig.3 DNMT3b mRNA expression products by 2%agarose gel electrophoresis

表1 大鼠肝組織中DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA表達(dá)水平Tab.1 DNMT3a mRNA and DNMT3b mRNA expression levels in rat liver tissues

3 討 論

目前誘導(dǎo)性大鼠肝癌模型的制作主要應(yīng)用二乙基亞硝胺和AFB1，制作過程中常加入四氯化碳、2-乙酰氨基芴、二甲基亞砜等促癌劑或切除部分肝葉促癌。因AFB1為人類HCC明確的病因之一，其誘導(dǎo)大鼠HCC模型的制作、癌變機(jī)制的研究倍受重視。本組大鼠模型中，25周大鼠肝組織病變以肝細(xì)胞變性損傷為主，37周時(shí)多數(shù)大鼠肝組織可見肝細(xì)胞異型性明顯，表現(xiàn)為癌前病變?yōu)橹鳎?3周時(shí)大鼠肝細(xì)胞則可見典型肝癌。觀察到肝細(xì)胞呈變性損傷，異型性到癌變；線粒體由增生腫脹到枯竭、空泡變；糖原顆粒呈漸減少等特征性變化。還觀察到典型肝細(xì)胞吞噬細(xì)胞現(xiàn)象。不足之處：與用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌模型相比，AFB1誘導(dǎo)模型的制作周期明顯延長，制作費(fèi)用高，大鼠病死率較高(17.86%)。

一般認(rèn)為，AFB1誘導(dǎo)肝癌機(jī)制與引起基因組遺傳性改變有關(guān)，與誘導(dǎo)DNA甲基化模式異常改變的機(jī)制未引起重視。研究表明，DNMT活性增加能促進(jìn)DNA堿基中甲基化的胞嘧啶脫氨基，胞嘧啶加速變?yōu)樾叵汆奏ぃ瑢?dǎo)致DNA易于發(fā)生點(diǎn)突變；促進(jìn)腫瘤抑制基因發(fā)生高甲基化，引起其表達(dá)沉寂，參與正常細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)變的發(fā)生和發(fā)展［8-9］。Park等［10］報(bào)道，DNMT3a和DNMT3b在人HCC癌腫組織中表達(dá)的陽性率(59.3%和55.6%)均顯著高于癌旁非腫瘤組織中的陽性率(22.2%和0%，P均<0.05)，認(rèn)為DNMT3a、DNMT3b與人HCC發(fā)生有關(guān)。OH等［11］報(bào)道，DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA在人HCC癌腫組織中表達(dá)水平最高，均明顯高于慢性肝炎、肝硬化組織(癌旁肝組織)和正常組織，DNMT3b mRNA在正常肝組織與HCC癌旁慢性肝炎、肝硬化組織的表達(dá)水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也認(rèn)為DNMT3a、DNMT3b基因參與人肝細(xì)胞的癌變機(jī)制。

目前有關(guān)AFB1誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞癌變演進(jìn)過程中DNMT3基因表達(dá)水平變化的研究少見報(bào)道。本研究中，DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA在大鼠肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織、損傷肝組織和早期癌變肝組織。結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)論相類似。與OH等 結(jié)果不同，DNMT3b mRNA在對照組37周肝組織中的表達(dá)水平均明顯高于大鼠損傷病變肝組織、對照組正常大鼠肝組織，不能除外可能因致癌因素不同引起的結(jié)果差異。另外，Oh等［11］報(bào)道5例HCC癌腫組織和癌旁非癌腫組織中，DNMT3a mRNA表達(dá)水平相近，4例DNMT3b mRNA表達(dá)水平相近。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，提示可能除DNMT3 mRNA表達(dá)變化以外，尚有其他致肝細(xì)胞癌變機(jī)制。

細(xì)胞自噬現(xiàn)象是一種腫瘤抑制機(jī)制，與癌前病變、癌細(xì)胞增殖及其抑制存在密切關(guān)系［12-13］。本研究2只大鼠肝癌組織中觀察到典型的肝細(xì)胞吞噬細(xì)胞現(xiàn)象，其癌組織中DNMT3a mRNA表達(dá)水平近似于其他肝組織，1只大鼠癌組織中DNMT3b mRNA表達(dá)較高。肝細(xì)胞吞噬細(xì)胞現(xiàn)象發(fā)生機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。

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