楊艷 仇小強(qiáng), 曾小云 貝春華

1.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；

2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度惡性的腫瘤，目前普遍認(rèn)為它的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年已證實(shí)慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致肝癌的重要原因，慢性HBV患者中約有10%～25%的患者最終發(fā)展為HCC［1］。在我國90%以上肝癌患者伴有HBV感染［2］。HBV的免疫清除，對(duì)促進(jìn)肝功能恢復(fù)、防止和減少HCC的發(fā)生有著最根本的意義。研究表明，細(xì)胞因子作為宿主對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的重要免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，在宿主清除病毒的免疫應(yīng)答、以及抗腫瘤過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用［3-4］。其中TNF-a作為機(jī)體炎癥應(yīng)答過程中產(chǎn)生的第1個(gè)細(xì)胞因子［5］，在宿主清除病毒的免疫應(yīng)答中的作用令人關(guān)注。

TNF-α是主要由單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其基因位于6號(hào)染色體p21區(qū)域內(nèi)，包含于HLAⅢ基因中。研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織TNF-α表達(dá)增多，肝癌患者體內(nèi)TNF-a水平相對(duì)健康人群高，TNF-α參與了肝損傷、肝纖維化及肝癌的病理發(fā)生、發(fā)展過程［6］。由于TNF-α不是預(yù)先儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)而是在受到刺激時(shí)合成的，因此，基因啟動(dòng)子區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)具有重要的意義。近年來已經(jīng)有研究證實(shí)TNF-α基因啟動(dòng)子SNP影響TNF-α的表達(dá)，從而使不同個(gè)體對(duì)某些疾病易感性和疾病進(jìn)程不同［7］。

本研究是在廣西地區(qū)開展的一項(xiàng)病例對(duì)照研究，以探討TNF-a基因多態(tài)性與HCC易感性的關(guān)系。本研究查找HapMap數(shù)據(jù)庫(http://www.hapmap.org/index.html.zh)，中國北京的漢族人分型數(shù)據(jù)，以最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>5%作為標(biāo)準(zhǔn)［8］，同時(shí)兼顧位點(diǎn)的生物學(xué)功能性，選擇了TNF-α基因-1031C/T(rs1799964)和TNF-α基因-308A/G(rs1800629)2個(gè)功能性位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)和分析，以評(píng)價(jià)TNF-α基因多態(tài)性對(duì)廣西地區(qū)人群HCC易感性的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究方法開展本次研究。研究對(duì)象包括620例HCC患者和625例非腫瘤患者。參照2001年9月在廣州召開的第八屆全國肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議上正式通過的“原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)”，病例組來源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、附屬腫瘤醫(yī)院和廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的住院患者。所有患者均為來自于廣西地區(qū)的經(jīng)組織病理學(xué)或臨床確診、未經(jīng)放射和抗癌藥物治療的新發(fā)病例。對(duì)照組選自上述醫(yī)院同期住院的脊柱骨科、創(chuàng)傷手外科和眼科的非腫瘤患者，無腫瘤病史和特征，無遺傳疾病，與病例組來自相同地區(qū)(居住10年以上)，并按照性別、年齡(±5歲)和民族與病例組頻數(shù)匹配。

1.2 方法

1.2.1 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查

采用調(diào)查問卷的方法，經(jīng)調(diào)查對(duì)象知情同意后，以統(tǒng)一的調(diào)查表收集每個(gè)研究對(duì)象詳細(xì)的人口學(xué)資料和相關(guān)危險(xiǎn)因素暴露資料，調(diào)查之前對(duì)調(diào)查人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)。并于研究對(duì)象入院次日清晨采集空腹外周靜脈血3 mL，置于真空ACD抗凝管中，混勻備用，于當(dāng)日提取基因組DNA。

1.2.2 基因分型

采用常規(guī)酚-氯仿法提取研究對(duì)象的基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＿\(yùn)用TaqMan MGB實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)TNF-α基因-1031C/T(rs1799964)和TNF-α基因-308A/G(rs1800629)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。使用7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括2×通用PCR Master mix 12.5 μL，40×基因分型試劑0.625 μL，去離子水10.875 μL，DNA (1～10 ng/μL) 1 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 min，92 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。7 500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、基因分型分析SDS軟件、通用PCR Master mix和基因分型試劑均購于美國ABI公司。

1.3 質(zhì)量控制

現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的質(zhì)量控制詳見文獻(xiàn)［9］。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制如下：實(shí)驗(yàn)采用雙盲法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前先抽取一部分樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，充分估計(jì)實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問題。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程預(yù)防交叉感染。為確定實(shí)驗(yàn)的可靠性，設(shè)立陽性、陰性對(duì)照，隨機(jī)抽取5%的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致率為100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)錄入與分析分別采用EpiData 3.0和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件；用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分別分析計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料。應(yīng)用非條件Logistic回歸計(jì)算比值比(odds ratios，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象一般人口學(xué)特征

所有研究對(duì)象均來自廣西地區(qū)，年齡16～83歲，病例組平均年齡(48.44±11.07)歲，對(duì)照組平均年齡(48.38±12.36)歲，兩組的年齡、性別、民族的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組在主要混雜因素方面均衡可比；吸煙、飲酒、慢性HBV感染及有食魚生史的人數(shù)比例，病例組均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，表1)。

2.2 基因型頻率分布及與HCC患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

625例對(duì)照組患者TNF-α基因-1031C/T(rs1799964)和-308A/G(rs1800629)位點(diǎn)基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(rs1799964：χ2=0.006，P=0.936；rs1800629：χ2=0.226，P=0.635)，表明研究對(duì)象具有人群代表性。

病例組中TNF-α基因-1031位點(diǎn)TT、CT和CC基因型頻率分別為61.60%、34.20%和4.20%，T和C等位基因頻率分別為78.70%、21.20%，對(duì)照組中TNF-α基因-1031位點(diǎn)TT、CT和CC基因型頻率分別為62.40%、33.10%和4.50%，C和T等位基因頻率分別為79.00%和21.00%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組TNF-a基因-308位點(diǎn)GG、GA及AA基因型頻率分別為80.00%、19.00%、1.00%，G和A等位基因頻率分別為89.50%、10.50%，對(duì)照組中TNF-α基因-308位點(diǎn)GG、GA及AA基因型的頻率分別為81.60%、17.30%和1.10%，G和A等位基因頻率分別為90.20%、9.80%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表1 病例組和對(duì)照組的一般人口學(xué)特征和環(huán)境危險(xiǎn)因素分布Tab.1 Demographic and environment risk factors in HCC and controls[n(%)]

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，調(diào)整年齡、性別、民族、食魚生史、吸煙、飲酒和慢性HBV感染后，TNF-α基因-1031C/T位點(diǎn)及-308A/G位點(diǎn)各基因型在調(diào)整前后與HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均不存在顯著關(guān)聯(lián)(表2)。

2.3 基因多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用分析

利用叉生分析原理，分別計(jì)算同時(shí)暴露于遺傳與環(huán)境因素或單獨(dú)暴露于遺傳或環(huán)境因素的危險(xiǎn)性，即OR值，遺傳與環(huán)境因素均未暴露的病例和對(duì)照組作為共同參比組，即OR=1，從而判別基于不同模型的兩因素間交互作用是否存在及其作用大小。通過分別對(duì)TNF-α基因-1031位點(diǎn)及-308位點(diǎn)多態(tài)性與吸煙、飲酒、食魚生史和HBV慢性感染等可疑危險(xiǎn)因素進(jìn)行叉生分析，結(jié)果顯示，-1031位點(diǎn)分別與吸煙、飲酒和HBV慢性感染3種環(huán)境危險(xiǎn)因素均存在交互作用(因?yàn)?1031位點(diǎn)有食魚生史在對(duì)照組中只有一種基因型，所以沒能做進(jìn)一步分析)；而-308位點(diǎn)分別與吸煙、飲酒、食魚生史和HBV感染4種環(huán)境危險(xiǎn)因素均存在交互作用(表3、4)。

表2 TNF-α基因多態(tài)性與HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)Tab.2 TNF-α gene polymorphisms and HCC risk[n(%)]

表3 TNF-α基因-1031C/T多態(tài)與環(huán)境危險(xiǎn)因素的交互作用分析Tab.3 Interactions analysis between TNF-α gene -1031C/T polymorphisms with environment risk factors(n)

表4 TNF-α-308A/G多態(tài)與環(huán)境危險(xiǎn)因素的交互作用分析Tab.4 Interactions analysis between TNF-α-308A/G polymorphisms with environment risk factors(n)

3 討 論

基于TNF-α在機(jī)體炎癥反應(yīng)中的重要地位，近年來關(guān)于TNF-α基因多態(tài)性與HBV感染宿主易感性方面一直是研究的熱點(diǎn)。TNF-α啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中5個(gè)典型的SNPs位點(diǎn)分別是-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A和-1031T/C，目前研究最多的是-308G/A位點(diǎn)。TNF-α-308位點(diǎn)存在G被A取代的現(xiàn)象，G存在時(shí)定義為常見型TNF1，A存在時(shí)定義罕見型TNF2［10］。Satoh等［11］的研究結(jié)果顯示，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)-308位點(diǎn)SNPs可影響TNF-α表達(dá)，-308位點(diǎn)G被A替換后，TNF-α轉(zhuǎn)錄效率增加7倍。Louis等［12］發(fā)現(xiàn)TNF-α-308A等位基因攜帶者TNF-α全血中的表達(dá)水平比G等位基因純合子高。Ho等［13］對(duì)TNF多態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α-308A基因型與HCC危險(xiǎn)性增加有關(guān)，且HCC的危險(xiǎn)性隨基因型從-308G/G、-308G/A到-308A/A的變化逐漸增高。本研究中，HCC患者攜帶TNF-α-308A等位基因的頻率與非腫瘤患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與Ho等［13］的研究報(bào)道不一致，可能是因?yàn)榇嬖跇颖玖俊⒎N族、地區(qū)以及研究方法等方面的不同所致。

TNF-α基因位于6號(hào)染色體p21區(qū)域內(nèi)，包含于HLAⅢ基因中。這個(gè)有著豐富SNPs的區(qū)域存在著廣泛的連鎖不平衡狀態(tài)。Hohjoh等［14］發(fā)現(xiàn)，取自日本志愿者捐獻(xiàn)的外周血單核細(xì)胞經(jīng)刀豆蛋白A激活后，攜帶TNF-α-1031C/-863A和TNF-α-857T基因的個(gè)體比攜帶TNF-α-1031T/-863C和TNF-α-857C基因的個(gè)體，其TNF-α轉(zhuǎn)錄活性分別增加了2.0和1.7倍，并且發(fā)現(xiàn)-1031C與HLA-DRBl*0901存在在明顯的連鎖不平衡。Sinha等［15］研究發(fā)現(xiàn)攜帶-1031C/-863A的個(gè)體，無論是瘧疾患者還是健康患者，其外周血中TNF表達(dá)水平比較高，提示TNF-α基因轉(zhuǎn)錄活性與其啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性有關(guān)。我們的研究并未發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的攜帶-1031C等位基因個(gè)體與HCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，可能是因?yàn)門NF-α啟動(dòng)子部分的SNPs以單倍型的形式對(duì)疾病的發(fā)生產(chǎn)生影響；或TNF-α啟動(dòng)子部分的SNPs靠近主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)，使其處于連鎖不平衡狀態(tài)，而后者對(duì)某些疾病有重要的影響。

本研究基因與環(huán)境的交互作用分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因-1031位點(diǎn)和-308位點(diǎn)SNP與吸煙、飲酒及HBsAg陽性和吸煙、飲酒、食魚生及HBsAg陽性等環(huán)境因素在HCC發(fā)生中存在交互作用。在動(dòng)物模型中，吸煙能激活全身炎癥反應(yīng)，并且通過改變炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子的水平來增加TNF-a的表達(dá)水平［16-17］。Bennet等［18］發(fā)現(xiàn)在吸煙者中，攜帶-857T等位基因和稀有TNF-α啟動(dòng)子區(qū)單倍型的個(gè)體其外周血中的TNF-α表達(dá)水平較高。Yang等［19］在研究TNF-a基因SNPs及其與吸煙的交互作用對(duì)胃癌發(fā)生的影響中發(fā)現(xiàn)，在吸煙者中，攜帶TNFα-1031T/C、TNF-α-863C/A、TNF-α-857C/T組成的CAT單倍型的個(gè)體罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)-1031位點(diǎn)和-308位點(diǎn)SNPs與吸煙有交互作用，可顯著增加HCC的患病風(fēng)險(xiǎn)。

宋韶芳等［20］發(fā)現(xiàn)，TNF-α-308A等位基因與飲酒、HBsAg陽性、肝病史在HCC發(fā)生中存在一定的交互作用，與本研究結(jié)果一致。飲酒是肝癌的重要危險(xiǎn)因素之一。酒精可以激活某些參與細(xì)胞損害的細(xì)胞因子(如TNF-α等)，誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450等微粒體酶的活性，影響DNA甲基化和細(xì)胞信號(hào)通路，增加鐵在肝沉積等途徑，協(xié)同病毒通過激活癌基因(如RAS等)，干預(yù)細(xì)胞凋亡或直接促進(jìn)基因突變而致癌［21］。本研究發(fā)現(xiàn)-1031位點(diǎn)TC或CC基因型同時(shí)有飲酒史者患HCC的危險(xiǎn)性是無飲酒史TT基因型者的4.71倍，-308位點(diǎn)GA或AA基因型同時(shí)有飲酒史者患HCC的危險(xiǎn)性是無飲酒史GG基因型者的5.32倍。

HBV感染是HCC的主要危險(xiǎn)因素，持續(xù)HBV感染者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)比正常人高20倍以上，而且HBV攜帶者肝臟炎癥和肝纖維化程度越嚴(yán)重，其風(fēng)險(xiǎn)越大［22］。臨床發(fā)現(xiàn)HBV患者的TNF-α含量明顯高于健康對(duì)照組，它的含量與病毒復(fù)制活躍有關(guān)，并且隨炎癥程度及纖維化程度加重而升高［23］。本研究結(jié)果顯示，-1031位點(diǎn)TC或CC基因型同時(shí)有HBsAg陽性者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型HBsAg陰性者的25.43倍，-308位點(diǎn)GA或AA基因型同時(shí)伴HBsAg陽性者患HCC的危險(xiǎn)性是GG基因型同時(shí)HBsAg陰性者的19.82倍。

本研究發(fā)現(xiàn)-308位點(diǎn)GA或AA基因型同時(shí)喜食魚生者患HCC的危險(xiǎn)性是無食魚生史的GG基因型者的24.98倍，這可能與廣西地區(qū)人群喜食魚生而感染肝吸蟲有關(guān)。由于肝吸蟲的刺激及其分泌物的毒性作用，可使膽管上皮細(xì)胞增生，長(zhǎng)期的刺激使這類患者的炎癥反應(yīng)和膽管上皮異常增生比不攜帶TNF-α-308A等位基因的患者嚴(yán)重，導(dǎo)致癌變的風(fēng)險(xiǎn)增加［20］。

雖然本次研究未提示-1031位點(diǎn)和-308位點(diǎn)SNPs與HCC的發(fā)生有明顯的關(guān)聯(lián)，但表明吸煙、飲酒、食魚生及HBsAg這些環(huán)境因素與SNPs在HCC的發(fā)生中存在一定的交互作用，這種交互作用加重了單一因素對(duì)機(jī)體的危害。目前，雖然不能通過改變個(gè)體的基因型來預(yù)防HCC的發(fā)生，但是可以通過改變環(huán)境危險(xiǎn)因素的暴露措施，如改變不良生活習(xí)慣、接種乙肝疫苗等措施減少肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

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