成 功, 裴 贏 瑩, 張 公 亮, 侯 紅 漫

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為餐桌上的佳肴早已聞名遐邇。2003年,我國(guó)海參的總產(chǎn)量只有3.9萬(wàn)t左右,2008年已經(jīng)達(dá)到了9萬(wàn)t,經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值超過(guò)200億元。但是,隨著海參養(yǎng)殖量的增加,海區(qū)的養(yǎng)殖壓力加大,海水污染嚴(yán)重,加上海參本身的水分、蛋白質(zhì)含量高,是一種很好的培養(yǎng)基,使得海參體內(nèi)外含有豐富的微生物類群,甚至存在著多種致病菌[1]。因此,近年來(lái)頻繁出現(xiàn)“腐皮綜合癥”,導(dǎo)致海參大批量死亡[2]。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)海參微生物菌群的研究還不夠系統(tǒng),特別是海參體表微生物的組成更是少有報(bào)道。孫奕等[3]從刺參前后消化管、體腔液和表皮上分離到359株細(xì)菌分別屬于弧菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、不動(dòng)桿菌屬、柄桿菌屬(Caulobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)這11個(gè)主要菌屬。向怡卉等[4]對(duì)大連產(chǎn)海參(仿刺參)不同部位的細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定,得到3種菌株,分別為Kocuriaroseastackebrandt、棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)和有毒威克斯菌(WeeksellaviroseHolmes),其中有毒威克斯菌是一種致病菌,其余兩種為優(yōu)勢(shì)菌。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大連冬、春兩季海參體表微生物進(jìn)行分離培養(yǎng),同時(shí)結(jié)合表型鑒定和分子遺傳學(xué)鑒定的方法對(duì)未知菌進(jìn)行準(zhǔn)確定位,較為系統(tǒng)地分析了海參體表的微生物菌群,為海參病害原因分析、防治以及海參生產(chǎn)加工提供一定的參考依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

2009年11月23日和2010年3月5日從大連長(zhǎng)興鮮活海產(chǎn)品市場(chǎng)購(gòu)買質(zhì)量約為200 g的大連仿刺參,在運(yùn)輸過(guò)程中加養(yǎng)殖所用海水,并且充氧以保持樣品的鮮活狀態(tài),30 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。用滅菌生理鹽水沖洗數(shù)遍,無(wú)菌條件下剪取各部分體表樣品。

1.2 樣品處理

稱取10 g體表樣品加入90 mL無(wú)菌生理鹽水,用滅菌勻漿器充分研磨均勻后,以10倍遞增稀釋法進(jìn)行稀釋,取3個(gè)合適的稀釋度涂布于2216培養(yǎng)基[5]、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基[6]。每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行,25 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3 細(xì)菌的分離純化

挑選菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板,綜合菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)分離純化所有菌株。

1.4 細(xì)菌的鑒定

1.4.1 細(xì)菌的形態(tài)和理化特性檢測(cè)

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。對(duì)分離純化的菌株作革蘭氏染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài),然后進(jìn)行生理生化特性測(cè)定,并作初步鑒定和常規(guī)分類。

1.4.2 模板制備及16S rDNA的PCR擴(kuò)增

將初步鑒定分類好的細(xì)菌接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基,25 ℃,150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后,按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)菌DNA,作為PCR反應(yīng)的DNA模板。PCR擴(kuò)增引物為通用引物27f和1492r,PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min,30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 60 s；60 ℃ 40 s；72 ℃ 90 s),72 ℃續(xù)延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.3 16S rDNA序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中利用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較,選取同源性較高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列作為參比對(duì)象,用Clustal X軟件按照最大同源性的原則進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.4.4 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

采用MEGA4.0軟件依據(jù)鄰位相連法對(duì)所有分離鑒定菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行分析比較,繪出系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

挑取稀釋度為10-3的樣品分別涂布于3種培養(yǎng)基,不同培養(yǎng)基獲得的菌落數(shù)量有明顯的差異,對(duì)3種培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),結(jié)果如表1所示。

表1 仿刺參體表菌群的數(shù)量

Tab.1 The quantity of the surface microflora ofApostichopusjaponicus

組別c/(μmol·L-1)t/h244872A值抑制率/%A值抑制率/%A值抑制率/%對(duì)照組01.414±0.0041.376±0.0221.192±0.008實(shí)驗(yàn)組1001.128±0.003a20.251.015±0.001a26.220.791±0.003a33.651500.874±0.003a38.190.815±0.003a40.750.604±0.003a49.262000.642±0.000 6a54.620.534±0.002a61.170.420±0.003a64.782500.513±0.006a63.720.405±0.008a70.600.283±0.002a76.253000.317±0.003a77.600.273±0.003a80.160.072±0.007a93.98注:a表示差異P<0.05。

2.2 生理生化反應(yīng)

從仿刺參體表分離得到的菌株經(jīng)革蘭氏染色后,鏡檢觀察菌體形態(tài)和菌落形態(tài),根據(jù)鏡檢結(jié)果將其劃分為10組,然后對(duì)這10組菌做常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

表2 細(xì)菌生理生化結(jié)果

Tab.2 The results of bacterial physiological and biochemical analysis

組別12345678910形狀rrrrrc/rrrrc革蘭氏染色-------+++運(yùn)動(dòng)性+++++--++-接觸酶-++++-++++氧化酶++++-+----葡萄糖產(chǎn)酸+--+++++++葡萄糖產(chǎn)氣----------吲哚------+--+明膠液化+-++++-++-檸檬酸鹽-+----++--注:r為桿菌,c/r為球桿菌,c為球菌;“+”代表陽(yáng)性反應(yīng);“-”代表陰性反應(yīng)。

2.3 菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增

將菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小1 500 bp左右,凝膠電泳圖如圖1所示。圖1中的目的條帶大小為1 500 bp,為各菌株的16S rDNA,之后將各菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序。

圖1 菌株P(guān)CR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.4 菌株16S rDNA的同源性比對(duì)

將測(cè)定菌株的16S rDNA的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中,與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16S rDNA序列相似性最高為100%,最低為97%。結(jié)果表明,從大連地區(qū)仿刺參體表分離得到的細(xì)菌分屬于10個(gè)菌,分別為交替假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、枯草芽孢桿菌、變形菌屬、Alteromonadaceas、不動(dòng)桿菌屬、解淀粉芽孢桿菌、腐生葡萄球菌。仿刺參體表細(xì)菌的菌相組成如表3所示。

2.5 仿刺參體表可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

仿刺參體表細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,所得到的19條有效序列中交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和弧菌屬(vibrio)同屬于γ-變形菌綱；變形桿菌屬(Proteobacterium)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloiquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)同源關(guān)系較近；Bacillussubtilis(AY881647.1)與Vibrio-cyclitrophicus(AM422804.1)同源關(guān)系較近。仿刺參體表細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示。

圖2 仿刺參體表細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹

Tab.3 The composition of bacterial flora on the surface ofApostichopusjaponicus

組別細(xì)菌冬季海參春季海參綜合菌株數(shù)/個(gè)所占比例/%菌株數(shù)/個(gè)所占比例/%菌株數(shù)/個(gè)所占比例/%革蘭氏陰性菌5484.33278.18681.91交替假單胞菌屬1828.1819.52623.82弧菌屬1320.31024.62422.93希瓦氏菌屬1117.2717.11817.14假單胞菌屬46.212.454.85變形菌屬34.712.443.86Alteromonadaceas——24.821.97不動(dòng)桿菌屬57.837.387.6革蘭氏陽(yáng)性菌1015.7921.91918.18枯草芽孢桿菌69.337.398.69解淀粉芽孢桿菌46.424.865.710腐生葡萄球菌——49.843.8總計(jì)6410041100105100注:“—”代表未檢測(cè)出。

3 討 論

本研究表明,從大連仿刺參體表分離得到的細(xì)菌中的假單胞菌屬、弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬為海水中主要的細(xì)菌[7-8],說(shuō)明這些細(xì)菌很可能是附生在仿刺參體表的。從仿刺參中分離得到大量的交替假單胞菌,交替假單胞菌是海洋底部泥土中一種非常常見和重要的細(xì)菌,是一種條件致病菌,在海帶、海藻、魚類、貝類等海洋生物體內(nèi)都有分布,它的營(yíng)養(yǎng)要求低,能生活在各種環(huán)境中。交替假單胞菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素、脂酶、卵磷脂酶、蛋白酶及外毒素等,這些物質(zhì)很多與致病性有關(guān)。仿刺參體表中分離出大量該菌種,很可能與仿刺參的生活習(xí)性有關(guān)。目前關(guān)于交替假單胞菌的致病性研究和關(guān)于其性質(zhì)的報(bào)道比較少,孟慶國(guó)等[9]在國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道交替假單胞菌是養(yǎng)殖刺參潰瘍性的病原菌。

腐敗和致病菌是危害水產(chǎn)品細(xì)菌學(xué)研究的兩個(gè)主要方面,其中對(duì)腐敗菌的研究更為普遍。假單胞菌和希瓦氏菌為常見優(yōu)勢(shì)腐敗菌,特別是在水產(chǎn)品的冷卻鏈過(guò)程中假單胞菌和希瓦氏菌為鮮活水產(chǎn)品的特定腐敗菌[10]。本實(shí)驗(yàn)在冬春兩季的海參體表均分離出一定數(shù)量的希瓦氏菌和假單胞菌,因而建議盡可能縮短海參加工前的冷藏過(guò)程。

許多報(bào)告指出,在自然環(huán)境中有相當(dāng)多的菌種(約90%～99%)用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法無(wú)法培養(yǎng)出來(lái)[11]；并且利用傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)微生物菌群進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),會(huì)不可避免地造成菌株的富集或衰減,對(duì)結(jié)果造成偏差。如果將傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)和非培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合使用,則可以相輔相成,更全面地反映復(fù)雜環(huán)境中微生物群落的種類。

[1] 石曉輝,李太武,陳燕,等. 發(fā)病仿刺參細(xì)菌的分離鑒定和生長(zhǎng)特性的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2009, 28(8):435-438.

[2] 王印庚,榮小軍,張春云,等. 養(yǎng)殖刺參爆發(fā)性疾病——“腐皮綜合癥”的初步研究與防治[J]. 齊魯漁業(yè), 2004, 21(5):44-47.

[4] 向怡卉,蘇秀榕,董明敏,等. 海參細(xì)菌的分離鑒定和生長(zhǎng)特性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006, 6(1):25-29.

[5] NAOMI W R, FRED A R, ERKO S. A study of the bacterial flora associated with Holothuria atra[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 1996, 203(1):11-26.

[6] 覃映雪,王曉林,鄢慶枇,等. 青石斑魚腸道菌群研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2007, 28(5):18-23.

[7] 潘蔚明. 海洋漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)中的細(xì)菌監(jiān)測(cè)[J]. 海洋水產(chǎn)科技, 1994(1):38-41.

[8] LA ROSA T, MIRTO S, MARINO A, et al. Heterotrophic bacteria community and pollution indicators of mussel-farm impact in the Gulf of Gaeta(Tyrrhenian Sea)[J]. Marine Environmental Research, 2001, 52(4):301-321.

[9] 孟慶國(guó),吳劉記,吳信忠,等. 養(yǎng)殖刺參潰瘍病病原學(xué)研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2006, 25(12):636-639.

[10] GRAM L, HUSS H H. Microbioloical spoilage of fish and fish products[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 33(1):121-137.

[11] RONDON M R, AUGUST P R, BETTERMANN A D. Cloning the soil metagenome:a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(6):2541-2547.