程 菁 恒, 朱 蓓 薇, 吳 海 濤, 孫 進(jìn) 健

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,EC 3.1.3.1,簡稱ALP)廣泛存在于動(dòng)物、植物與微生物中。在化學(xué)組成上,ALP為含鋅的糖蛋白,是一類在堿性條件(pH 9～11)下具有高催化活性,能催化幾乎所有磷酸單酯鍵生成無機(jī)正磷酸和對(duì)應(yīng)醇、酚和糖等物質(zhì)的一組水解酶類[1]。ALP作為動(dòng)物代謝過程中重要的調(diào)控酶參與磷代謝活動(dòng),與海水中磷質(zhì)和鈣質(zhì)的吸取、磷酸鈣的生成、甲殼素的形成和分泌直接相關(guān),且參與動(dòng)物體內(nèi)鈣磷的代謝,維持適宜的鈣磷比例,對(duì)動(dòng)物的生存具有重要的意義[2]。

目前,從水產(chǎn)原料中提取堿性磷酸酶的研究報(bào)道很多,包括白鰱[3]、黃鱔[4]、泥鰍[5]、鮑魚[6]、背角無齒蚌[7]、合浦珠母貝[8]、鋸緣青蟹[9]、長牡蠣[10]、北極蝦[11]、扇貝[12]等,但關(guān)于海參堿性磷酸酶的研究還未見報(bào)道。本論文以海參加工中的副產(chǎn)物——海參腸為原料,從中提取堿性磷酸酶,并通過研究最適溫度及溫度穩(wěn)定性、最適pH及pH穩(wěn)定性、金屬離子和抑制劑對(duì)其的影響,初步探討海參腸堿性磷酸酶的酶學(xué)性質(zhì),豐富海參的酶學(xué)理論。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

新鮮海參腸,購自大連長興水產(chǎn)市場；對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(p-NPP),購于上海生工生物工程有限公司；牛血清蛋白為Fluka(Switzerland)產(chǎn)品,其他所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

UV-2100型分光光度計(jì),UNIC(USA)；Z323K型冷凍離心機(jī),HERMIE(GERMANY)；JJ 200Y型精密電子天平,美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司；8050型超濾裝置,Millipore corporation,Bedford,M； YC-1型層析實(shí)驗(yàn)冷柜,北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；pHS-3型精密pH計(jì),上海雷磁儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 海參腸ALP的提取

海參腸經(jīng)清洗后,稱取200 g,加入600 mL預(yù)冷的含0.2% Triton X-100的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 8.9)打漿。勻漿液于4 ℃浸提8 h,在13 500 r/min下冷凍離心15 min,收集上清液。按1∶4的體積比向上清液中加入經(jīng)預(yù)冷的正丁醇,4 ℃攪拌過夜以脫脂釋放膜蛋白,在13 500 r/min下冷凍離心15 min,收集上清液。在4 ℃下,緩慢加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到70%(每100 mL上清液中加入43.6 g硫酸銨),鹽析6～8 h。經(jīng)13 500 r/min冷凍離心15 min后,收集沉淀。沉淀用適量的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 8.9)溶解,再用該緩沖液透析48 h。收集透析液,采用10 ku的超濾膜進(jìn)行超濾(4 ℃)去除小分子蛋白,收集未透過部分,分裝,于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 海參腸ALP活力的測定

參照Sigma公司的配制方法,將p-NPP溶于甘氨酸緩沖液(0.2 mol/L,pH 10.4)中配成10 mmol/L的底物溶液。堿性磷酸酶活力的測定參照Xiao等[8]和Pinoni等[13]的方法,并有所改進(jìn)。具體方法如下:1 mL底物溶液中加入1 mL稀釋過的酶液,于37 ℃下反應(yīng)1 h,最后加入4 mL、0.4 mo1/L NaOH溶液終止反應(yīng),混勻后于405 nm下測定吸光度。以未加入酶液的溶液(用Tris-HCl緩沖液代替)作空白組。在此條件下,以每小時(shí)催化底物釋放l μmol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為1個(gè)活力單位,以對(duì)硝基苯酚和牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算海參腸堿性磷酸酶比活力。

1.3.3 海參腸ALP最適pH及pH穩(wěn)定性的測定

坤二少爺哈哈一笑，說：“莊府門前的一棵棗樹，滿樹紅棗壓彎了枝頭，熟透的棗子落在地上無人去撿。如果這戶人家有小孩子，樹上樹下會(huì)是這般光景？”

配制濃度為50 mmol/L,具有不同pH的溶液。分別為Gly-HCl緩沖液(pH 1.0～3.0),HAc-NaAc緩沖液(pH 4.0～6.0),Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～8.0),Gly-NaOH緩沖液(pH 9.0～10.0),NaHCO3-NaOH緩沖液(pH 11.0～12.0),NaOH溶液(pH 13.0～14.0)。

測定最適pH時(shí),取待測酶液加入Tris-HCl(pH 8.9)緩沖液中,稀釋20倍。取出等量的酶液,用不同pH的緩沖液分別稀釋酶液(1 000倍以上),按照“1.3.2”的方法測定酶活；測定pH穩(wěn)定性時(shí),稀釋的酶液在室溫靜置1 h后,再按照“1.3.2”的方法測定酶活。

1.3.4 海參腸ALP最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測定

測定最適溫度時(shí),酶液用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 8.9)稀釋至一定倍數(shù),分別于20～70 ℃與底物反應(yīng)。測定溫度穩(wěn)定性時(shí),先將稀釋的酶液于20～70 ℃下保溫1 h,再與底物反應(yīng),酶活測定方法同“1.3.2”。

1.3.5 金屬離子對(duì)海參腸ALP活力的影響

取等量酶液,在反應(yīng)體系中,分別加入Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、K+、Mn2+等金屬離子,使其終濃度達(dá)到1和10 mmol/L。酶活測定方法同“1.3.2“,以未加入金屬離子酶液的酶活力為100%,按照下式計(jì)算相對(duì)酶活力。

相對(duì)酶活力=加入金屬離子的酶活力/未加入金屬離子的酶活力×100%

1.3.6 抑制劑對(duì)海參腸ALP活力的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 海參腸ALP的提取

在提取海參腸ALP過程中,其純化倍數(shù)和得率如表1所示,經(jīng)正丁醇脫脂處理、硫酸銨沉淀及超濾濃縮后,海參腸ALP的比活力、純化倍數(shù)呈逐漸增加的趨勢,得率逐步下降,超濾濃縮后得到的海參腸ALP粗酶純化倍數(shù)達(dá)到2.74倍,得率為63.32%。

表1 海參腸堿性磷酸酶的分離純化

Tab.1 Isolation and purification of ALP from the gut of sea cucumber

純化步驟m(總蛋白)/mg總活力/U比活力/(U·mg-1)純化倍數(shù)得率/%粗酶液1 700.05 677.93.341.00100.00正丁醇處理728.94 967.76.822.0487.49硫酸銨處理(透析后超濾)392.73 595.09.152.7463.32

2.2 海參腸ALP的最適pH及其pH穩(wěn)定性

由圖1可知,海參腸ALP在酸性及中性條件下(pH 3.0～7.0)活力很低,pH 8.0～12時(shí)具有一定的酶活力,其中在pH 11.0時(shí)達(dá)到最大,隨著pH的進(jìn)一步提高,酶活力完全喪失(pH 13.0～14.0)。從圖2可見,海參腸ALP在pH 10.0～12.0時(shí)穩(wěn)定性較高。海參腸ALP的最適pH略高于其他來源的ALP(如中國對(duì)蝦[14]、黃鱔[4]、鮑魚[6]、鰱魚[3]、三角帆蚌[15]中的ALP最適pH均在10.0左右),其pH穩(wěn)定性范圍相對(duì)狹窄,在pH 10.0～12.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。

圖1 pH對(duì)海參腸ALP活性的影響

Fig.1 Effect of pH on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

圖2 pH對(duì)海參腸ALP穩(wěn)定性的影響

Fig.2 Effect of pH on the stability of ALP from the gut of sea cucumber

2.3 海參腸ALP的最適溫度及其溫度穩(wěn)定性

由圖3可知,在20～45 ℃范圍內(nèi),隨著反應(yīng)溫度的升高,海參腸ALP活力逐漸增強(qiáng),在45 ℃時(shí)達(dá)到最大值；隨著溫度的繼續(xù)升高,酶活力逐漸下降。海參腸ALP的最適pH與其他動(dòng)物來源的ALP相同,如從合浦珠母貝(Pinctadafucata)[8]和番鴨小腸[16]中提取得到的ALP,其最適溫度均為45 ℃。圖4顯示了海參腸ALP在20～45 ℃有很高的穩(wěn)定性,隨著溫度的繼續(xù)升高,酶活力呈現(xiàn)快速下降的趨勢,至60 ℃后酶活力完全喪失；而張繼平等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)草魚ALP在45 ℃以下熱變性,酶活力基本保持不變,在45 ℃以上酶活力開始下降,并隨著處理溫度升高,酶活力呈快速下降。

圖3 溫度對(duì)海參腸ALP活性的影響

Fig.3 Effect of temperature on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

圖4 溫度對(duì)海參腸ALP穩(wěn)定性的影響

Fig.4 Effect of temperature on the stability of ALP from the gut of sea cucumber

2.4 金屬離子對(duì)海參腸ALP的影響

ALP是一種金屬酶,金屬離子對(duì)維持其分子構(gòu)象和催化活性有重要作用。按“1.3.5”所述方法測定不同金屬離子對(duì)海參腸ALP活性的影響,結(jié)果如表2所示。由表2可知,在1和10 mmol/L的濃度下,Zn2+和Mg2+對(duì)海參腸ALP有明顯的激活作用,Ca2+對(duì)其有略微激活作用,而Cu2+可抑制其活性；Fe2+、Fe3+和Mn2+在低濃度下(1 mmol/L) 對(duì)海參腸ALP有略微或明顯的激活作用,而在高濃度下(10 mmol/L)則顯著抑制該酶活力。Dong和Zeikus等[18]通過研究新阿波羅棲熱袍菌(Thermotoganeapolitana)中的堿性磷酸酶,也得出2 mmol/L 的Zn2+、Mg2+和Ca2+對(duì)ALP有激活作用。Chen等[19]通過研究不同金屬離子對(duì)鋸緣青蟹ALP活性影響,發(fā)現(xiàn)Cu2+、Mn2+等重金屬離子對(duì)其有抑制作用,但Zn2+也對(duì)ALP有抑制作用,當(dāng)其濃度為20 μmol/L時(shí),剩余酶活力為80%,并隨濃度的增加剩余酶活力逐漸減少。

表2 金屬離子對(duì)海參腸ALP的影響

Tab.2 Effect of metal ions on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

金屬離子c/(mmol·L-1)相對(duì)酶活力/%c/(mmol·L-1)相對(duì)酶活力/%Zn2+1133.410119.7Fe2+1101.91058.7Fe3+1109.41060.6Mg2+1131.510166.9Ca2+1106.110104.3Cu2+193.11072.8Mn2+1133.51078.9

考察不同濃度Zn2+、Mg2+對(duì)海參腸ALP活力的影響,所得結(jié)果如圖5所示。海參腸ALP的活力隨著Zn2+濃度增大而逐漸減少,并且在Zn2+濃度達(dá)到15 mmol/L后對(duì)ALP的影響表現(xiàn)為抑制作用。隨著Mg2+濃度的增加,海參腸ALP的活力也逐漸增大,當(dāng)Mg2+濃度達(dá)到30 mmol/L時(shí),海參腸ALP活力增加了99.1%。

2.5 抑制劑對(duì)海參腸ALP的影響

圖5 Zn2+和Mg2+濃度對(duì)海參腸ALP活力的影響

Fig.5 Effect of concentrations of Zn2+and Mg2+on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

圖6 抑制劑對(duì)海參腸ALP的影響

Fig.6 Effect of inhibitors on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

3 結(jié) 論

(1)海參腸堿性磷酸酶粗酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃,在20～45 ℃范圍內(nèi)有很高的穩(wěn)定性。

(2)海參腸堿性磷酸酶粗酶的最適pH為11,在pH 10.0～12.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。

(3)金屬離子Mg2+(1～30 mmol/L)、Zn2+(<10 mmol/L)對(duì)海參腸ALP粗酶有顯著的激活作用,Fe3+、Fe2+、Cu2+和Mn2+(10 mmol/L)可明顯抑制該酶活力。

(4)EDTA-Na2、DTT、Na2WO4及Na2HPO4對(duì)海參腸ALP粗酶有明顯的抑制作用,抑制程度依次為:EDTA-Na2>DTT>Na2WO4>Na2HPO4。

[1] de BACKER M, MCSWEENEY S, RASMUSSEN H B, et al. The 1.9 A crystal structure of heat-labile shrimp alkaline phosphatase[J]. Journal of Molecular Biology, 2002, 318(5):1265-1274.

[2] 張輝,張海蓮. 堿性磷酸酶在水產(chǎn)動(dòng)物中的作用[J]. 河北漁業(yè), 2003, 131(5):12-13.

[3] 許敏. 白鰱腸堿性磷酸酶的分離純化及其性質(zhì)研究[D]. 重慶:西南大學(xué), 2007.

[4] 黃毅. 黃鱔肝臟堿性磷酸酶的分離純化及部分動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2009, 28(6):313-316.

[5] 唐云明. 泥鰍堿性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1998, 21(3):336-339.

[6] 廖金花,陳巧,林麗蓉,等. 鮑魚堿性磷酸酶的分離純化和性質(zhì)研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2005, 44(2):273-275.

[7] 張洪淵,劉克武,姜云,等. 背角無齒蚌堿性磷酸酶的功能基團(tuán)研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 1997, 21(4):48-352.

[8] XIAO Rui, XIE Li-pin, LIN Jing-yu, et al. Purfication and enzymatic characterization of alkaline phosphatase fromPinctadafucata[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2002, 17:65-74.

[9] 陳清西,張喆,莊總來,等. 鋸緣青蟹堿性磷酸酶分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 海洋與湖沼, 1998, 29(4):62-367.

[10] 李興暖,韓雅莉,肖湘,等. 長牡蠣堿性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 臺(tái)灣海峽, 2003, 22(4):483-486.

[11] NILSEN I W, ?VERb? K, OLSEN R L. Thermolabile alkaline phosphatase from Northern shrimp (Pandalusborealis):protein and cDNA sequence analyses[J]. Comparative Biochemstry and Physiology Part B, 2001, 129(4):853-861.

[12] 歐陽培,陳曉鷺,錢海年. 扇貝堿性磷酸酶的分離提純及性質(zhì)研究[J]. 熱帶海洋, 1986, 5(3):50-56.

[13] PINONI S A, GOLDEMBERG A L, LOPEZ MANANES A A. Alkaline phosphatase activities in muscle of the euryhaline crabChasmagnathusgranulatus:Response to environmental salinity[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2005, 326:217-226.

[14] 何海琪,孫鳳. 中國對(duì)蝦酸性和堿性磷酸酶的特性研究[J]. 海洋與湖沼, 1992, 23(5):555-560.

[15] 萬謙,張洪淵. 三種淡水育珠蚌堿性磷酸酶比較酶學(xué)的初步研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào), 1994, 31(2):264-268.

[16] 劉建昌,余萬凱,池雪林,等. 番鴨小腸堿性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 39(2):165-167.

[17] 張繼平,林建成,謝進(jìn)金,等. 草魚堿性磷酸酶的分離純化與部分性質(zhì)研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2005, 44(5):684-687.

[18] DONG Guo-qiang, ZEIKUS J G. Purification and characterization of alkaline phosphatase fromThermotoganeapolitana[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1997, 21:335-340.

[19] CHEN Qing-xi, ZHENG Wen-zhu, LIN Jing-yu, et al. Effect of metal ions on the activity of green crab (Scryllaserrata) alkaline phosphatase[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2000, 32(8):879-885.