梁子敬 汪友平 賴(lài)榮德

【摘要】目的 探討血必凈對(duì)油酸誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷后肺纖維化的影響。方法 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠60只，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為3組（n=20）：A組注射生理鹽水作為健康對(duì)照組；B、C兩組所有大鼠均用油酸復(fù)制急性肺損傷模型，B組為模型對(duì)照組，C組在模型基礎(chǔ)上加用血必凈為干預(yù)組。3組均于注射后12 h抽動(dòng)脈血作血?dú)夥治鰷y(cè)定血氧分壓，以氧合指數(shù)≤300為造模成功。確定模型成功后，A、B兩組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水（4 ml/kg），C組經(jīng)尾靜脈給予血必凈（4 ml/kg），每天1次，連續(xù)給藥7 d。各組于給藥后24 h、7 d、14 d和28 d各處死5只大鼠，取心臟血后處死大鼠，左肺稱(chēng)濕質(zhì)量后行支氣管肺泡灌洗，灌洗后烘干稱(chēng)質(zhì)量，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)血清和支氣管肺泡灌洗液Ⅲ前膠原（PCⅢ）濃度，取右肺上葉行肺組織病理學(xué)檢查，經(jīng)石蠟包埋切片后分別行蘇木素-伊紅（HE）染色和Masson染色。各組間比較采用單因素方差分析，均數(shù)間差別多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；非正態(tài)分布或方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果 B、C兩組氧合指數(shù)（PaO₂/FiO₂）＜300，與A組比較明顯下降(P＜0.05)；與A組相比，B、C組在7、14、28 d 3個(gè)時(shí)點(diǎn)血清和支氣管肺泡灌洗液中Ⅲ前膠原蛋白的濃度增高（P＜0.01）, C組與B組相比在14 d和28 d兩時(shí)點(diǎn)血清PCⅢ濃度降低（P＜0.05），C組在7、1d和28 d時(shí)點(diǎn)支氣管肺泡灌洗中Ⅲ前膠原蛋白的濃度比同時(shí)段的B組降低（P＜0.01）。結(jié)論 血必凈可能通過(guò)抑制急性肺損傷后肺纖維化而有助于損傷肺保護(hù)。

【關(guān)鍵詞】急性肺損傷；急性呼吸窘迫綜合征；肺纖維化；血必凈注射液；油酸；Ⅲ前膠原蛋白；HE染色；Masson 染色

Effect of Xuebijing on lung fibrosis in a rat model of oleic acid-induced lung injury LIANG Zi-jing, WANG You-ping, LAI Rong-de. Emergency Department,The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120,China

Corresponding author: LIANG Zi-jing, Email: liang-zj-doctor@163.com

【Abstract】Objective To investigate the effect of Xuebijing (Chinese herbal medicine preparation) on lung fibrosis in a rat model of oleic acid-induced lung injury. Methods Sixty SPF level of male Wistar rats were randomly (random number) divided into three groups (n= 20): normal control group (group A)，oleic acid model group (group B)，oleic acid and Xuebijing group (group C). Rats in group A were injected with normal saline (0.13 ml/kg); acute lung injury (ALI) model rats were injected with oleic acid (0.13 ml/kg) intravenously in B and C groups. Twelve hours after administrations of saline or oleic acid into rats of three groups separately, samples of arterial blood from all rats were taken for blood gas analysis. By analysis of blood oxygen partial pressure, the acute lung injury model successfully made was confirmed. Then the rats in group C were treated with xuebijing (4 ml/kg) intravenously, once a day from the 1st to 7th day. The rats in groups A and B were treated with saline (4 ml/kg). Five rats in each group were randomly sacrificed on the 1st ，7th，14th，28th day, separately. The bronchoalveolar lavage (BAL) of left lung of all rats was carried out after weight of lung weighed．The left lungs of rats were weighed in wet and dry in order to get the wet/dry ratio. Venous blood and BAL fluid (BALF) were obtained for detection of procollagen Ⅲ (PCⅢ) concentrations with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Right upper lobe of lung specimens was taken for histopathological examination after paraffin-embedded sections with hematoxylin-eosin ( HE) staining and Masson staining . Multiple comparisons were analyzed by using one-way analysis of variance (SNK-q test). Statistical analyses were performed by using SPSS 13.0 software. Results Oxygenation index of groups B and C (PaO₂/FiO₂<300) significantly decreased compared with the group A (P<0.01). Levels of serum PCⅢ on the 14th day and 28th day in group C decreased significantly in comparison with group B (P<0.05). Compared with group A, the levels of BALF PCⅢ and serum PCⅢ in group B and group C on the 7th day, 14th day and 28th day increased (P<0.01). Levels of PCⅢ in BALF on the 7th day, 14th day and 28th day in C group decreased in comparison with group B (P<0.01). Compared with group A, the levels of PCⅢ in BALF in group B and group C on the 7th day, 14th day and 28th day increased (P<0.05).Conclusions The result suggests that treatment with xuebijing may be useful in inhibiting pulmonary fibrosis during the course of ALI in rats.

【Key words】Acute lung injury; Acute respiratory distress syndrome; Pulmonary fibrosis; Xuebijing; Oleic acid; Ⅲ procollagen; HE staining; Masson staining

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是臨床常見(jiàn)的急重癥，急性呼吸窘迫綜合征( acute respiratory distress syndrome，ARDS)為ALI的嚴(yán)重階段。持續(xù)急性呼吸窘迫綜合征是以肺纖維化增強(qiáng)，進(jìn)行性的炎癥、長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械通氣和高病死率為特征，肺損傷后肺纖維化可能是影響患者生存質(zhì)量的重要因素。近年來(lái)的研究提示在ALI的早期即可出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生和膠原分泌增強(qiáng)，Marshall等^［1］發(fā)現(xiàn)在ALI的嚴(yán)重階段ARDS發(fā)病24 h內(nèi)血清和支氣管肺泡灌洗液中Ⅲ型前膠原質(zhì)量濃度在死亡患者中更高。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有14種不同類(lèi)型的膠原，主要是I型和Ⅲ型膠原(其前身為PCⅢ)；細(xì)胞外基質(zhì)的沉積增多主要是膠原蛋白的增加。通過(guò)檢測(cè)反映肺纖維化指標(biāo)的PCⅢ可以從一定程度上了解到肺纖維化肺內(nèi)膠原沉積及其血中膠原含量的變化趨勢(shì)^［2］。有研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥制劑血必凈對(duì)急性肺損傷和肺纖維化治療可能有益^［3-4］，為此本研究使用血必凈對(duì)油酸至ALI模型進(jìn)行干預(yù)，探討其可能的作用機(jī)制和療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器材

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(226±10)g(購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證書(shū)：SCXK(粵)2009-0011。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地：廣州呼吸病研究所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2009-0093。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材 血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：Z20040033）;10%中性福爾馬林（廣州化學(xué)試劑廠）；大鼠羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠PCIII測(cè)試盒（B＆G，上海藍(lán)基生物公司，批號(hào):E02P0047）；血?dú)夥治鰞x及試紙（美國(guó)ABBOTT公司）；油酸（廣東汕頭化學(xué)品廠）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 60只SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為A、B、C三組：A組20只為健康對(duì)照組，B組20只為ALI模型組，C組20只為治療干預(yù)組。

1.2.2 制模及方法 A組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.13 ml/kg作為健康對(duì)照。B組與C組分別給予注射油酸0.13 ml/kg ,12 h后經(jīng)尾動(dòng)脈取血0.2 ml立即用手持式血?dú)夥治鰞x器行血?dú)夥治霾⒋蛴〗Y(jié)果，以氧合指數(shù)PaO₂/FiO₂≤300為造模成功，確定模型成功后C組經(jīng)尾靜脈注射血必凈（4 ml/kg）,A組和B組注射N(xiāo)S（4 mL/kg）,每天給藥1次，連續(xù)7 d，期間對(duì)大鼠活動(dòng)、飲食及體質(zhì)量密切觀察。分別于給藥后24 h、7 d、14 d、28 d隨機(jī)處死5只大鼠，并按設(shè)計(jì)要求留取標(biāo)本。

1.2.3 標(biāo)本處理 麻醉后經(jīng)心臟取血約4 mL,注入離心管經(jīng)兩次離心后取上清液約1.5 ml -80 ℃低溫冰箱冷凍保存待測(cè)，取出心肺照相后，左肺稱(chēng)濕質(zhì)量后,60 ℃恒溫烘干72 h至恒重后稱(chēng)干質(zhì)量并計(jì)算W/D，取右肺下葉-80 ℃冷凍保存待測(cè)，右肺上葉用10%甲醛固定常規(guī)包埋、切片，進(jìn)行HE和Masson染色后鏡檢及讀片。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè) ELISA法檢測(cè)血清中Ⅲ型前膠原，在酶標(biāo)儀上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量得出其濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，在符合正態(tài)分布和方差齊性同時(shí)，組間均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（One-way ANOVA），均數(shù)間差別多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；非正態(tài)分布或方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧合指數(shù)的比較

B、C組與A組比較，氧合指數(shù)有顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 肺組織病理改變

2.4.1 大體病理 A組的肺組織色澤淡紅，表面光滑；B組肺組織明顯充血、水腫、表面滲出增多，體積明顯增加，多呈暗紫色并伴有多灶性出血；C組肺組織水腫，體積增大，色澤暗紅陳舊性出血較模型組有所減輕。

2.4.2 顯微鏡下觀察 正常肺組織HE和Masson染色（×200）：A組肺泡內(nèi)無(wú)明顯滲出，肺泡壁連續(xù)，僅在血管周見(jiàn)一些藍(lán)色的膠原纖維。第14 天模型組可見(jiàn)肺泡腔消失由膠原纖維替代，成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)，淺藍(lán)色的原纖維片狀分布；隨時(shí)間延長(zhǎng)膠原纖維進(jìn)行性增加，28 d模型組可見(jiàn)彌漫性增生的纖維。C組肺纖維增值進(jìn)程與B組類(lèi)似，7 d、14 d和28 d時(shí)點(diǎn)可見(jiàn)在肺間質(zhì)間較多藍(lán)色的膠原沉積，但病理改變較B組減輕。見(jiàn)圖1。

A：正常肺組織肺泡間隔纖細(xì)，未見(jiàn)增生的纖維；B：正常肺組僅在血管周見(jiàn)一些藍(lán)色的膠原纖維；C：7 d治療血必凈組，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增寬，見(jiàn)一小片纖維組織增生伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；D：7 d治療血必凈組，在肺泡周?chē)梢?jiàn)一些藍(lán)色的膠原纖維；E：14 d模型組，肺組織結(jié)構(gòu)破壞可見(jiàn)一片新生的纖維母細(xì)胞灶，周?chē)梢?jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；F：14 d模型組，淺藍(lán)色的原纖維片狀分布；F：14 d治療組，肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，間隔見(jiàn)片狀增生的纖維組織伴少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；H：14 d治療組，可見(jiàn)藍(lán)色片狀的膠原纖維分布在肺泡間隔中；I：28 d模型組，肺泡結(jié)構(gòu)廣泛破壞，可見(jiàn)纖維組織彌漫大片狀增生，間質(zhì)見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；J：28 d模型組，可見(jiàn)彌漫增生的纖維灶片狀陽(yáng)性；K：28 d治療組，肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，見(jiàn)兩灶纖維母細(xì)胞灶，伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，L：28 d治療組，纖維母細(xì)胞灶表達(dá)式藍(lán)色

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)ALI后肺纖維化的研究主要集中在早期的炎癥反應(yīng)，而對(duì)ALI后肺纖維化的研究較少。肺纖維化是包括在ALI/ARDS的后期階段、特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）、自身免疫性膠原血管疾病、放射病等許多疾病的一種特征^［5-6］。在急性或慢性肺損傷后許多相關(guān)系統(tǒng)被激活，從而對(duì)肺泡毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行修復(fù)^［7］。肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增值、分化和遷徙可能修復(fù)損傷肺。更嚴(yán)重的損傷或不恰當(dāng)修復(fù)可能引起增值異常、成纖維細(xì)胞激活伴隨膠原蛋白和其他基質(zhì)蛋白增強(qiáng)表達(dá)^［8］。纖維化結(jié)果導(dǎo)致氣體交換降低、肺順應(yīng)性降低，促成肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展^［9］。盡管ALI/ARDS和IPF是截然不同的兩種臨床疾病，但成纖維細(xì)胞的激活和增值在兩者疾病的病理生理扮演重要角色。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)每年有40萬(wàn)人被診斷為ALI/ARDS或IPF，兩者均為高致死性疾病^［10］，故對(duì)急性肺損傷后纖維化進(jìn)行探討具有臨床意義。

近年來(lái)的研究提示在ALI的早期即可出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生和膠原分泌增強(qiáng)，炎癥和纖維化進(jìn)程緊密的重疊，但會(huì)出現(xiàn)各自的調(diào)節(jié)，因此提供對(duì)獨(dú)立于對(duì)影響纖維化的早期治療成為可能^［11］。保護(hù)性通氣策略的應(yīng)用是ALI治療的里程碑式進(jìn)展^［12］，但因肺泡炎癥滲出和間質(zhì)纖維增殖效應(yīng)，特別是后期的纖維化仍是其不良預(yù)后的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，盡管ARDS的致病因素不同，ALI/ARDS的基本組織病理過(guò)程常被描述為彌漫性肺泡損傷，進(jìn)程經(jīng)歷滲出、增殖、纖維化，三者之間互有重疊^［13］。滲出階段表現(xiàn)為：肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞扣押、血小板-纖維蛋白栓子形成、間質(zhì)水腫，肺泡腔內(nèi)充滿滲出液及纖維母細(xì)胞和紅細(xì)胞，透明膜形成；第2周左右為增殖階段，表現(xiàn)為肺泡內(nèi)滲出，Ⅱ型肺泡上皮、成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增殖發(fā)病3～4周以后，發(fā)生纖維增殖、纖維化，是后期的肺組織重構(gòu)表現(xiàn)。但有研究提示纖維增殖可在發(fā)病24 h內(nèi)出現(xiàn)，組織學(xué)改變可在發(fā)病2周內(nèi)表現(xiàn)出來(lái)^［14］。肺泡上皮破壞是ALI/ARDS的標(biāo)志，如何防止內(nèi)皮細(xì)胞破壞、遏制病情進(jìn)展，防止或減輕肺纖維化成為影響期預(yù)后的關(guān)鍵問(wèn)題，也是臨床醫(yī)生們的共同期待。大量的研究試圖應(yīng)用糖皮質(zhì)激素控制炎癥反應(yīng)，預(yù)防和治療ARDS，但結(jié)果一直存在爭(zhēng)議。最近有研究認(rèn)為盡管糖皮質(zhì)激素可能對(duì)改善心肺生理有益但是對(duì)患者遠(yuǎn)期預(yù)后無(wú)改善，認(rèn)為不支持對(duì)持續(xù)ARDS常規(guī)使用糖皮質(zhì)激素^{［11］。對(duì)此目前還測(cè)試了包括多種抗氧化劑、骨髓抑制劑和細(xì)胞因子抑制劑，但至今仍未取得有效的治療效果。為此筆者試圖用中藥制劑血必凈對(duì)此進(jìn)行探討。}

血必凈是由丹參、川芎、赤芍、紅花、當(dāng)歸等多味活血化瘀的中藥組成。已有研究顯示，血必凈中的丹參具有可改善微循環(huán)、較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抗氧自由基功效；川芎具有抗氧化、清除氧自由基、增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性、抑制中性粒細(xì)胞粘附集聚、活化；赤芍所含的赤芍總苷對(duì)缺氧、一氧化氮和氧自由基損傷有保護(hù)區(qū)效應(yīng)；當(dāng)歸中的當(dāng)歸多糖具有較強(qiáng)的清除活性氧自由基能力；紅花也有清除自由基作用^［15-16］。血必凈還具有拮抗內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性炎癥介質(zhì)失控性釋放，抑制血小板聚集等作用。研究發(fā)現(xiàn)血必凈對(duì)大鼠肝缺血-再灌注后ALI有保護(hù)作用，認(rèn)為可能與其抑制中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)集聚、減少氧自由基有關(guān)。血必凈對(duì)內(nèi)毒素?fù)p傷的內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可降低血漿中的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7的異常升高，減輕肺臟的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮肺組織的保護(hù)作用。本藥還具有抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)，可能通過(guò)抑制前膠原蛋白mRNA表達(dá)、降低脂質(zhì)過(guò)氧化酶含量、提高超氧化物歧化酶活性、減少成纖維細(xì)胞生成，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積;從而顯著減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)，改善肺纖維化程序，抑制肺纖維化發(fā)展^［3］。還有研究用血必凈聯(lián)合前列腺素E1能有效改善實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠的病理改變，并延緩其惡化進(jìn)程，認(rèn)為可能是通過(guò)抑制TNF-α、TGF-β1的表達(dá)，減輕早期炎癥反應(yīng)并減少膠原蛋白的產(chǎn)生，使炎癥及纖維化病變減輕，從而產(chǎn)生防治急性肺纖維化的作用^［16］。有研究通過(guò)血必凈對(duì)心跳驟停復(fù)蘇后大鼠干預(yù)發(fā)現(xiàn)血必凈可明顯調(diào)節(jié)心腦組織中的TGF-β1和p38MAPK含量。肺纖維化的增值包含膠原沉積和降解兩者之間復(fù)雜的作用過(guò)程^［17］。在ARDS時(shí)Ⅲ膠原是最先沉積，它容易被破壞，而后變?yōu)楦志玫蘑裥湍z原^［18］。通過(guò)檢測(cè)反映肺纖維化指標(biāo)的PCⅢ可以從一定程度上了解到肺纖維化肺內(nèi)膠原沉積其血中膠原含量的變化趨勢(shì)。本研究通過(guò)檢測(cè)血清和支氣管肺泡灌洗液中PCⅢ濃度以及肺組織病理等方面來(lái)了解ALI后肺纖維化的程度；以及通過(guò)血必凈干預(yù)來(lái)研究對(duì)ALI后肺纖維化的影響。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血必凈干預(yù)組血清和支氣管肺泡灌洗液中PCⅢ較模型組明顯減低,提示血必凈對(duì)大鼠ALI后肺纖維化有一定抑制，該藥有使平衡向好的方向轉(zhuǎn)換，血必凈對(duì)大鼠ALI治療有效。為臨床治療ALI提供新選擇但其臨床功效和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2012-01-17）

（本文編輯：何小軍）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.08.010

基金項(xiàng)目：廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2009-YB-237）

作者單位：510120 廣州，廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科

通信作者：梁子敬，Email: liang-zj-doctor@163.com

中華急診醫(yī)學(xué)雜志2012年8月第21卷第8期Chin J Emerg Med,August 2012,Vol.21,No.8

P840-845