高壓氧對大鼠Ｔ淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響

劉志紅 馮芳 王鋼

【摘要】目的 研究高壓氧對健康大鼠以及全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）大鼠T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α）等的影響。方法 40只雄性SD大鼠隨機（隨機數(shù)字法）分為5組。A組：腹腔注射生理鹽水（0.9% NaCl, 5 ml/kg）作為對照組；B組：腹腔注射等量生理鹽水，做3次高壓氧治療；C組：腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液（500 mg/kg）；D組：腹腔注射等量酵母多糖-石蠟懸液，做1次高壓氧治療；E組：腹腔注射等量酵母多糖-石蠟懸液，做3次高壓氧治療。所有大鼠均于腹腔注射24 h后處死，門靜脈取血，標(biāo)本采用流式細(xì)胞技術(shù)對CD3⁺CD4⁺CD8⁺進行計數(shù)，應(yīng)用ELISA方法檢測IL-6、IL-10、TNF-α血漿水平，以單因素方差分析及LSD-t檢驗分析數(shù)據(jù)。結(jié)果 高壓氧治療可顯著降低健康大鼠外周血CD4 T細(xì)胞百分比（P＜0.01），使CD4/CD8T細(xì)胞比值下降(P＜0.05)。酵母多糖腹腔注射使大鼠外周血CD4、CD8 T細(xì)胞均減少（P＜0.01）。1次和3次HBO治療可使酵母多糖所致CD4 T細(xì)胞減少明顯恢復(fù)(P＜0.01，P＜0.05)。對于未出現(xiàn)高炎癥反應(yīng)的大鼠，HBO治療可增加IL-6（P＜0.05)和TNF-α（P＜0.01)，而減少IL-10（P＜0.05)。結(jié)論 高壓氧可降低健康大鼠外周血CD4T細(xì)胞百分比。當(dāng)出現(xiàn)高炎癥反應(yīng)時，高壓氧可以明顯抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的爆發(fā)增多。高壓氧對健康大鼠和未出現(xiàn)高炎癥反應(yīng)的SIRS大鼠起促炎作用。

【關(guān)鍵詞】高壓氧；SIRS；T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞因子；免疫功能；TNF-α

Effect of hyperbaric oxygen on T-lymphoid cells and cytokines in rats LIU Zhi-hong, FENG Fang, WANG Gang. Emergency Department, First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China

Corresponding author: WANG Gang,Email:wg5385@sohu.com

【Abstract】Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygen therapy on T-lymphocytes l and cytokines including IL-6, IL-10 and TNF-α as indicators well representing immune function and inflammation in normal rats and rats with systemic inflammatory response syndrome. Methods Forty Sprague-Dawley male Rats were randomly (random number) divided into five groups. Rats of group A were treated by saline solution（0.9℅ NaCl, 5 ml/kg）, and served as control group; rats of group B were treated with saline solution and hyperbaric oxygen therapy three times; rats of group C were treated with zymosan (500 mg/kg); rats of group D were treated with zymosan and hyperbaric oxygen therapy once; and rats of group E were treated with zymosan and hyperbaric oxygen therapy three times. At 24 hours after saline or zymosan administration, rats were sacrificed and blood samples were collected from the portal vein. CD3⁺,CD4⁺,CD8⁺cells were counted by flow cytometer, and plasma levels of IL-6, IL-10 and TNF-α were measured by ELISA . The results were analyzed by one-way ANOVA and LSD post-hoc test. Results CD4 T cell of normal rats was decreased by hyperbaric oxygen (P<0.01), CD4/CD8 T cell ratio was also decreased (P<0.05). Of rats with zymosan administration, CD4 T cells and CD8 T cells were both decreased on a parallel (P<0.01). A single one HBO and HBO for three times both raised the percentage of CD4 T cells which was significantly decreased by zymosan administration (P<0.01 and P<0.05). In rats without hyper-inflammation, hyperbaric oxygen therapy showed a pro-inflammatory effect by elevating TNF-α (P<0.01), IL-6(P<0.05) and reducing IL-10 (P<0.05). Conclusions HBO reduces CD4 T cells in normal rats. HBO reduces the production of TNF-α,IL-6 and IL-10 during hyper-inflammation. HBO is pro-inflammatory in normal rats and minor SIRS rats withourt appreciable hyper-inflammation in circulation.

【Key words】Hyperbaric oxygen;Systematic inflammatory response syndrome;T- lymphocyte; Cytokine; Immune function ;TNF-α

高壓氧(HBO)作為一種治療手段，廣泛應(yīng)用于臨床。它可以促進受傷部位纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血管的增值，增強白細(xì)胞的氧化殺傷能力，對特殊厭氧菌有致命的殺傷力^［1］。高壓氧還表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞分子學(xué)反應(yīng)，包括細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因功能調(diào)節(jié)，高壓氧的生化作用包括調(diào)節(jié)黏附分子、生長因子和細(xì)胞因子的表達，微循環(huán)的灌注和細(xì)胞能量的干預(yù)等^［2］。然而，高壓氧在免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用方面的研究以及在全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）中的應(yīng)用尚不多見。SIRS從一個新的角度闡明多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要病理生理及發(fā)生發(fā)展過程。創(chuàng)傷、感染、休克發(fā)展到 MODS存在著一條共同通路，即SIRS^［3］。本實驗探討高壓氧作為輔助治療手段對一些以炎癥反應(yīng)為病理基礎(chǔ)的疾病是否具有普遍的治療意義。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量150～190 g。購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。酵母多糖-A（購自Sigma公司，美國），細(xì)胞亞群的分析使用以下特殊的單克隆抗體：抗大鼠FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8（購自biolegend公司，美國），TNF-α，IL-6，IL-10 的ELISA試劑盒購自欣博盛公司（R&D;公司分裝，美國）。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性SD大鼠40只隨機（隨機數(shù)字法）分為5組，每組8只。A組：腹腔注射生理鹽水（0.9% NaCl, 5 ml/kg）作為對照組；B組：腹腔注射等量生理鹽水（0.9%NaCl），做3次高壓氧（2ATA）治療，時間分別為腹腔注射后4 h、10 h、18 h。C組：腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液（500 mg/kg）；D組：腹腔注射等量酵母多糖-石蠟懸液，4 h以后做1次高壓氧治療（2ATA）；E組：腹腔注射等量酵母多糖-石蠟懸液后，做3次高壓氧治療（2ATA），時間分別為腹腔注射后4、10、18 h。注射之前，酵母多糖-石蠟懸液于100 ℃水浴 80 min滅菌。飼養(yǎng)條件：溫度（21±1 ）℃，相對濕度60％。規(guī)律光照，7:00-19:00。自由進水和進食。

1.3 動物SIRS模型的建立及模型成功的標(biāo)準(zhǔn)

通過腹腔注射酵母多糖引起大鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，通過觀察對比腹腔注射24 h后大鼠的呼吸頻率增加50%，體溫上升或下降1 ℃，以及皮膚發(fā)紺作為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 高壓氧治療方案

在透明動物氧艙內(nèi)（DWC400A/0.2-1，華信氧業(yè)有限公司，濰坊，山東）進行。加壓之前，100%純氧洗艙5 min，以清除艙內(nèi)原有空氣。勻速15 min加壓至2ATA。所有的動物經(jīng)過60 min的穩(wěn)壓治療，之后以同樣的速度減壓出艙。治療期間，艙內(nèi)以4 L/min的速度通氧以避免CO₂蓄積。

1.5 干預(yù)

所有大鼠均于固定時間點處死（腹腔注射后24 h），乙醚麻醉，門靜脈取血，血標(biāo)本EDTA抗凝。以紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，采用流式細(xì)胞技術(shù)，以熒光標(biāo)記抗體標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對CD3⁺CD4⁺CD8⁺進行計數(shù)，使用中國醫(yī)科大學(xué)中心實驗室Becton/Dickenson FACScan型流式細(xì)胞儀，每個標(biāo)本選取5000個細(xì)胞進行分析。血漿IL-6、IL-10、TNF-α按照ELISA試劑盒說明書操作進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s ）表示，運用SPSS 13.0 for Windows軟件，以單因素方差分析及LSD-t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酵母多糖對Ｔ細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響

注射酵母多糖的大鼠CD4和CD8 T細(xì)胞均較對照組明顯減少(P＜0.01)，減少程度基本平行，所以CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺無變化(表1圖1、2)。本實驗中，只有部分大鼠出現(xiàn)細(xì)胞因子明顯增多，其余與對照組比較無明顯變化(表2、圖3)。所以本研究將Ｃ組Ｄ組分別再分成Ｃ0和Ｃ1組、D⁰和D¹組，C¹同D¹組作為亞組單獨分析(圖4)。

2.2 高壓氧對健康大鼠Ｔ細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響

B組CD4 T細(xì)胞比例同對照組（A組）相比明顯減少(P＜0.01)，CD8 T細(xì)胞基本無變化，CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺比值明顯下降(P＜0.05)（表1、圖1、2）。高壓氧明顯增加IL-6 (P＜0.05)和減少IL-10(P＜0.01)。TNF-α基本無變化（表2、圖3）。

2.3 高壓氧對SIRS大鼠Ｔ細(xì)胞的影響

高壓氧使酵母多糖導(dǎo)致的CD4T細(xì)胞減少明顯恢復(fù)(P＜0.05)。同高壓氧對健康大鼠T細(xì)胞的影響一樣，高壓氧幾乎不影響CD8 T細(xì)胞，故CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺比值升高(P＜0.05)（表1、圖1、2）。

2.4 高壓氧對SIRS大鼠細(xì)胞因子的影響

一方面，與未產(chǎn)生高炎癥反應(yīng)的大鼠組（Ｃ0組）比較，三次高壓氧（E組）明顯增加IL-6(P＜0.05)和TNF-α(P＜0.01)，而減少IL-10(P＜0.05)，這種影響類似于正常組大鼠（圖3）。

另一方面，高壓氧（D¹組）明顯下調(diào)高炎癥反應(yīng)組（C¹組）增多的TNF-α，IL-6和IL-10的趨勢。由于亞組的數(shù)據(jù)過少不能進行有效統(tǒng)計學(xué)分析，不能得出確定的結(jié)論。但不可忽視C¹和D¹組中確實存在高壓氧顯著抑制高炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子的趨勢。見表2和圖4。

2.5 一次高壓氧和三次高壓氧對T細(xì)胞和

細(xì)胞因子的不同影響D組和E組的CD4 和CD8T細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1圖1、2)。也就是說，三次高壓氧治療對于CD4 T細(xì)胞的恢復(fù)并不比一次高壓氧治療具有更好的效果。與未產(chǎn)生高炎癥反應(yīng)的高壓氧處理大鼠組（D⁰組）比較，三次高壓氧（E組）明顯上調(diào)TNF-α（P＜0.01）、IL - 6（P＜0.05）和下調(diào)IL-10（P＜0.05）。因此，在無高炎癥反應(yīng)時，三次高壓氧治療較一次有更明顯的促炎癥作用（圖3）。由于E組未出現(xiàn)高炎癥反應(yīng)大鼠，可以推斷，三次高壓氧在減輕高炎癥反應(yīng)方面可能比一次更有效。

3 討論

研究表明酵母多糖致大鼠SIRS嚴(yán)重程度具有劑量依賴性^［5-6］，本實驗參考相關(guān)文獻^［7-10］選取500 mg/kg體重進行酵母多糖腹腔注射，但只有部分大鼠出現(xiàn)高炎癥反應(yīng)。這一現(xiàn)象可以由SIRS的發(fā)生機制來解釋。根據(jù)Bone的SIRS5個時期的分期理論^［4-5］，在本實驗中，同對照組（A組）相比注射酵母多糖大鼠（C⁰組）的細(xì)胞因子沒有明顯增多意味著僅處于SIRS的第一階段，即局限性炎癥反應(yīng)階段，另一部分大鼠（C¹組）則出現(xiàn)經(jīng)典SIRS，所以我們能在循環(huán)中檢測出高水平的細(xì)胞因子。經(jīng)典SIRS發(fā)生機制可能具有類似“全或無”效應(yīng)。當(dāng)刺激強度不足以使所有大鼠均發(fā)生過度炎癥反應(yīng)時，具有較強抵抗力的動物僅處于SIRS第1期，表現(xiàn)為局部炎癥反應(yīng)。我們推測引起不同反應(yīng)的差異主要在于免疫功能，但其中不一定與經(jīng)典的CD4，CD8T細(xì)胞直接相關(guān)，因為本實驗中CD4，CD8T細(xì)胞比例在所有注射酵母多糖的大鼠中均減少，其程度與是否出現(xiàn)高炎癥反應(yīng)無相關(guān)。說明CD4，CD8T細(xì)胞是比細(xì)胞因子更早反應(yīng)的免疫細(xì)胞，在未出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)時已經(jīng)受累，并且可能這種受累是相對獨立的，不因炎癥反應(yīng)的加重而加重。推測CD4、CD8T細(xì)胞的這種減少可能是在對抗局部炎癥反應(yīng)過程中消耗的，也有可能是SIRS本身引起的細(xì)胞凋亡，并認(rèn)為這種凋亡可能是全身炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)促炎與抗炎反應(yīng)平衡的關(guān)鍵因素^［11-13］。

高壓氧對正常機體和疾病狀態(tài)機體表現(xiàn)出截然不同的作用^［14］。一方面，在機體處于高炎癥狀態(tài)時，高壓氧可以減少炎癥介質(zhì)的合成和釋放，增加SOD活性，清除過多氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，提高膿毒癥生存率，改善缺血再灌注損傷^{［10,14-18］}。另一方面，高壓氧對內(nèi)源性免疫和適應(yīng)性免疫產(chǎn)生廣泛抑制。包括減少抗原合成，抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體；損傷Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的促炎型免疫反應(yīng)；高壓氧可以非特異性刺激T細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-10，以產(chǎn)生強大的免疫抑制作用^［18-19］。在本實驗中，高壓氧對健康組大鼠（B組）和酵母多糖組（D組和E組）大鼠有不同的作用效果，類似 “雙刃劍”作用。造成高壓氧這種“雙刃劍”作用的原因可能是：a）壓力， 2.5ATA高壓氧時膿毒癥大鼠病死率降低，3ATA時病死率明顯增高，說明高壓氧和免疫功能改變之間可能存在劑量-依賴關(guān)系^{［14，16，20］}；b）暴露時間，有體外實驗顯示^［18］，高壓氧在最初的幾個小時可以使外源性刺激后TNF-α的合成減少，但是長時間暴露之后其合成又表現(xiàn)出顯著的增加^［16］。

短暫的高壓氧暴露作為一種細(xì)胞信號刺激可通過影響IL-10的產(chǎn)生來發(fā)揮其作用^［14］，其機制可能是直接影響IL-10的基因轉(zhuǎn)錄或是通過增加或抑制其他的細(xì)胞因子來間接改變分泌IL-10 細(xì)胞的表型^［21］。有研究表明，高壓氧可以影響巨噬細(xì)胞在細(xì)胞氧化狀態(tài)下的表型。巨噬細(xì)胞可被分類為還原型巨噬細(xì)胞或氧化型巨噬細(xì)胞，氧化型巨噬細(xì)胞受刺激后表達IL-6和IL-10增強，還可以引導(dǎo)Th2型T細(xì)胞反應(yīng)，具有明顯的抗炎作用^［22］。但高壓氧介導(dǎo)的IL-10變化并不都是由巨噬細(xì)胞特異性完成的，IL-10可以由許多細(xì)胞型產(chǎn)生，包括樹突細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞^［14］，說明高壓氧對免疫細(xì)胞沒有特殊的影響。高壓氧暴露后，由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)受刺激產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子明顯減少。高壓氧可誘導(dǎo)抗氧化酶和具有抗炎作用的蛋白^［23］。高壓氧通過抑制cox-2表達從而下調(diào)前列腺素E2的產(chǎn)生，或誘導(dǎo)熱休克蛋白的合成來抑制TNF-α的產(chǎn)生^［16］。刺激迷走神經(jīng)也可以明顯抑制膿毒癥時TNF的合成和釋放^［24］。在本實驗中，單次高壓氧暴露就具有明顯的抗炎以及恢復(fù)CD4T細(xì)胞的作用，說明高壓氧這種有益作用可以長期持續(xù)^［25］至少24 h。雖然一次高壓氧同三次高壓氧的作用無統(tǒng)計學(xué)差異，但三次高壓氧治療組未現(xiàn)出高炎癥反應(yīng)大鼠，這說明在抑制高炎癥爆發(fā)方面，三次高壓氧比一次高壓氧可能更有效。

高壓氧抑制TNF-α和IL-6增多的作用可能拓展出一個新的臨床應(yīng)用方向——慢性炎癥性疾病，這是一類背景不同、癥狀各異但病理基礎(chǔ)相似的疾病。在慢性炎癥疾病中，幾乎都有不同程度的循環(huán)TNF-α和IL-6水平升高^［26］。筆者推測高壓氧引起的抗炎作用是非特異性的，雖然具體機制尚不完全清楚，但至少提示了高壓氧對各種急慢性以炎癥反應(yīng)為主要臨床特點的疾病可能具有普遍的輔助治療意義。

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（收稿日期：2012-04-01）

（本文編輯：何小軍）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.08.011

作者單位：110001 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科（劉志紅、王鋼）；沈陽市蘇家屯區(qū)中心醫(yī)院（馮芳）

通信作者：王鋼，Email：wg5385@sohu.com

中華急診醫(yī)學(xué)雜志2012年8月第21卷第8期Chin J Emerg Med,August 2012,Vol.21,No.8

P846-850