毛燕群

（重慶市涪陵監(jiān)獄衛(wèi)生所 408000）

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的傳染病，中國HCV感染率約為3.2%，其中40%～60%的感染者可發(fā)展為慢性丙型肝炎，部分發(fā)展為肝硬化，嚴(yán)重威脅人們的健康［1－2］。HCV感染的早期診斷是預(yù)防和治療丙型肝炎的有效途徑。目前HCV檢測技術(shù)主要為抗－HCV抗體檢測和HCV RNA檢測，但二者均存在一定的局限性。外周血中HCV核心抗原（HCV core antigen，HCcAg）是HCV顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白，在各亞型HCV中高度保守，是理想的HCV感染標(biāo)志物［3］，其檢測對 HCV感染的診斷和治療具有重要意義。本文針對現(xiàn)存HCcAg檢測方法耗時(shí)、操作繁瑣等不足，建立一種快速靈敏檢測HCcAg含量的電化學(xué)免疫傳感器方法，并對其檢測性能進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 主要試劑：HCcAg和HCV核心抗體（HCV core antibody，HCcAb）購于美國Thermo公司；多壁碳納米管（multi－wall carbon nanotubes，MWCNTs），純度大于95%，購于成都有機(jī)化學(xué)研究所；牛血清清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、殼聚糖（chitosan，CS）及氯金酸購自美國Sigma公司。實(shí)驗(yàn)所 用 緩 沖液 均 為 含 5mmol／L ［Fe（CN）6］3－／4－和0.1mol／L KCl的 0.1mol／L 磷 酸 鹽 緩 沖 溶 液 （phosphate buffered solution，PBS）（pH 7.0），實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。主要設(shè)備：CHI 660D電化學(xué)工作站、玻碳電極（工作電極）、鉑絲（對電極）、Ag／AgCl電極（參比電極）、LIBROR AEL－200電子天平（日本島津公司），BRANSON B3200S－T恒溫超聲儀（上海必能信超聲公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金的制備 采用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠［4］，所得金溶膠為酒紅色，用透射電子顯微鏡表征，平均直徑約為16nm。

1.2.2 MWCNTs－CS（1.0g／L）的制備 方法參照文獻(xiàn)［5］，并在此基礎(chǔ)上做了一些改變。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的醋酸溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH到5.0。取50mg殼聚糖置于10mL上述醋酸溶液中，在室溫下攪拌一段時(shí)間制得5g／L的殼聚糖溶液。將5mg MWCNTs加入5mL 5g／L殼聚糖溶液中超聲溶解。

1.2.3 HCcAg免疫傳感器制作 玻碳電極經(jīng)0.30、0.05μm鋁粉拋光至鏡面后，用水沖洗干凈，分別于雙蒸水、乙醇、雙蒸水中超聲清洗5min，晾干待用。將5μL的MWCNTs－CS滴涂于預(yù)處理的玻碳電極表面，室溫晾干。在膠體金溶液中浸泡4h，取出后水洗，晾干，置于HCcAb溶液中于4℃過夜。最后在室溫下將電極浸入2.5g／L的BSA溶液中1h，以封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn)制成HCcAg電化學(xué)免疫傳感器，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測方法 將HCcAg標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水進(jìn)行倍比稀釋，配置成200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25ng／mL 6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在三電極體系下，將制備好的免疫傳感器插入含5mmol／L［Fe（CN）6］3－／4－和0.1mol／L KCl的0.1mol／L PBS溶液（pH 7.0）中，記錄免疫電極在穩(wěn)態(tài)時(shí)的空白電流值I0。然后與不同濃度的HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液于35℃反應(yīng)20min后，再在工作溶液中進(jìn)行變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）測試，記錄穩(wěn)定后的電流值I1。根據(jù)不同濃度的HCcAg所對應(yīng)的電流差值（ΔI）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中ΔI＝I0－I1。

1.4 性能評價(jià)采用回收試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)對該免疫傳感器檢測的準(zhǔn)確性和選擇性進(jìn)行分析，通過批內(nèi)、批間試驗(yàn)評價(jià)傳感器的精密度。（1）回收試驗(yàn)：用標(biāo)準(zhǔn)HCcAg溶液配置出濃度為100.00、50.00、20.00、10.00、5.00ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將制備好的HCcAg免疫傳感器分別于5個(gè)不同濃度的溶液中孵育20min，根據(jù)測得的實(shí)際濃度與標(biāo)準(zhǔn)濃度的百分比計(jì)算回收率。（2）干擾試驗(yàn)：往濃度為50.00ng／mL的 HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入2倍濃度的干擾物質(zhì)乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）、乙型肝炎病毒核心抗體 （hepatitis B virus core antigen，HBcAg），使 其 濃 度 為100.00ng／mL，加入干擾物前、后的電流值分別為Ia和Ib，按照公式計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），RSD＝（Ib－Ia）／Ia×100%。（3）批內(nèi)試驗(yàn)與批間試驗(yàn)：將制備好的免疫傳感器浸于100.00ng／mL HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育20min，相同條件下重復(fù)測定5次，計(jì)算批內(nèi)試驗(yàn)CV值；一次制備5支HCcAg免疫傳感器，分別于100.00ng／mL HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育20min，計(jì)算批間試驗(yàn)CV值。

2 結(jié) 果

HCcAg標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水進(jìn)行倍比稀釋后，分別采用免疫傳感器對6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，記錄電流變化值ΔI，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。結(jié)果表明，HCcAg濃度在2.50～300.00ng／ml范圍內(nèi)與ΔI成良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y＝0.159＋0.128 X，線性相關(guān)系數(shù)R＝0.997。將傳感器在空白溶液中連續(xù)掃描10次，根據(jù)3倍空白標(biāo)準(zhǔn)差與斜率的比值得出其檢出限為1.20ng／mL?；厥赵囼?yàn)結(jié)果見表1；干擾試驗(yàn)結(jié)果見表2；精密度檢測提示批內(nèi)試驗(yàn)CV值為4.5%，批間試驗(yàn)CV值為5.2%。

表1 回收試驗(yàn)

圖1 HCcAg濃度與峰電流變化的線性關(guān)系

表2 干擾試驗(yàn)

3 討 論

HCV為嗜肝性慢性病毒，HCV感染后，患者的起病和臨床癥狀極不典型，以亞臨床感染為多見，容易造成漏診。HCV感染的慢性化發(fā)生率明顯高于乙型肝炎病毒感染。與乙型肝炎比較，丙型肝炎更早出現(xiàn)肝硬化、肝癌，病死率也較高。因此HCV的檢測對HCV感染的早期診斷和指導(dǎo)臨床治療有重要意義。目前用于HCV感染診斷的兩項(xiàng)主要指標(biāo)為抗－HCV和HCV RNA，但存在“窗口期”漏檢的問題。作為抗－HCV檢驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)，HCcAg的檢測對處于HCV感染“窗口期”的個(gè)體檢測有很大價(jià)值。

目前，用于HCcAg檢測的方法主要有熒光酶免疫分析法［6］和酶聯(lián)免疫吸附法［7］，這些檢測方法雖然比較靈敏，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)。電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原抗體反應(yīng)可進(jìn)行特異性定量或半定量分析的集成器件，抗原（或抗體）是分子識別元件，且與電化學(xué)傳感元件直接接觸，通過傳感元件把某種或者某類化學(xué)物質(zhì)濃度信號轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號［8］。由于結(jié)合了免疫反應(yīng)的特異性和電化學(xué)傳感技術(shù)的高靈敏度，電化學(xué)免疫傳感器具有選擇性高、成本低和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)志物的檢測［9］。

本實(shí)驗(yàn)采用 MWCNTs－CS分散液修飾電極，一方面MWCNTs可以極大地促進(jìn)電子傳遞，從而提高電流響應(yīng)，增加檢測靈敏度；另一方面，殼聚糖成膜性好，含有大量氨基，在為HCV核心抗體提供良好的生物相容性環(huán)境的同時(shí)，通過氨基吸附大量的金納米粒子，增加抗體的負(fù)載量，從而也提高檢測的靈敏度。由圖1可知，該電化學(xué)免疫傳感器對HCcAg的響應(yīng)很好，表現(xiàn)出較寬的檢測范圍，HCcAg濃度在2.50～300.00ng／mL范圍內(nèi)與ΔI呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.997。而且檢出限較低，可以檢測到1.20ng／mL的抗原濃度，說明該免疫傳感器的靈敏度較高，可以用來檢測HCcAg含量較低的溶液。

本實(shí)驗(yàn)對制備的HCcAg電化學(xué)免疫傳感器的性能進(jìn)行了評價(jià)。表1為回收試驗(yàn)結(jié)果，通過回收試驗(yàn)反映該方法檢測的準(zhǔn)確性。HCcAg免疫傳感器分別在5個(gè)不同濃度的HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育20min，根據(jù)測得的實(shí)際濃度與標(biāo)準(zhǔn)濃度的百分比計(jì)算出回收率，本研究的回收率為96.60%～105.75%，說明該免疫傳感器檢測的準(zhǔn)確性較好。表2為干擾試驗(yàn)結(jié)果，可以用來說明該免疫傳感器檢測的選擇性，將HBsAg、HBeAg、HBcAg作為干擾物質(zhì)，分別加入到50.00ng／mL的HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中，使其濃度為100.00ng／mL，比較在有、無干擾物兩種情況下，傳感器的電流變化。由表2可知，加入2倍濃度的干擾物后，RSD為－3.0%～5.7%，表明該免疫傳感器具有良好的選擇性，可較特異地檢測出HCcAg。

此外，作者還分析了該方法的精密度。將免疫傳感器浸到100.00ng／mL HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育后，在相同條件下重復(fù)測定5次，RSD為4.5%；將同批次制備的5支免疫傳感器在相同條件下測定，RSD為5.2%，說明該傳感器有良好的重現(xiàn)性。

綜上所述，該電化學(xué)免疫傳感器在檢測HCcAg方面表現(xiàn)出較寬的線性范圍和較低的檢出限，而且具有良好的檢測性能。該方法的建立可以為HCcAg的檢測提供一種新的思路，有助于實(shí)現(xiàn)HCcAg的快速、靈敏檢測，對丙型肝炎的早期檢測具有一定的意義。

［1］ 朱豐村，奚經(jīng)巧.HCV檢測技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，26（2）：162－165.

［2］ 朱忠政，叢文銘.乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒在肝癌發(fā)生中的作用研究進(jìn)展［J］.中華肝臟病雜志，2003，11（9）：574－576.

［3］ 盧業(yè)成，江振友，鄺燕玲，等.游離丙型肝炎病毒核心抗原檢測的臨床價(jià)值探討［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23（7）：635－637.

［4］ FRENS G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions［J］.Nat Phys Sci，1973，241：20－22.

［5］ Huang KJ，Niu DJ，Xie WZ，et al.A disposable electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen based on nano－Au／multi－walled carbon nanotubes－chitosans nanocomposite film modified glassy carbon electrode［J］.Anal Chim Acta，2010，659（1／2）：102－108.

［6］ Kashiwakuma T，Hasegawa A，Kajita T，et al.Detection of hepatitis C virus specific core protein in serum of patients by a sensitive fluorescence enzyme immunoassay（FEIA）［J］.J ImmunolMethods，1996，190（1）：79－89.

［7］ 洪俊，饒永彩.HCV核心抗原測定用于丙型病毒性肝炎早期診斷臨床價(jià)值的評估［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2005，23（2）：133－133.

［8］ Zhang S，Zheng F，Wu Z，et al.Highly sensitive electrochemical detection of immunospecies based on combination of Fc label and PPD film／gold nanoparticle amplification［J］.Biosens Bioelectron，2008，24（1）：129－135.

［9］ 劉蓓，逯嶺松，劉成桂，等.基于 PoPD－MWCNTs－離子液體／納米金的髓過氧化物酶免疫傳感器［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2011，69（4）：438－444.