田海峰， 衣濤， 金東日＊

（1．延邊大學(xué)理學(xué)院 化學(xué)系，吉林 延吉133002；2．吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，吉林 延吉133001）

柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定蓮子心中去甲烏藥堿含量

田海峰1， 衣濤2， 金東日1＊

（1．延邊大學(xué)理學(xué)院 化學(xué)系，吉林 延吉133002；2．吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，吉林 延吉133001）

以9－芴甲基－N－琥珀酰亞胺基碳酸酯（Fmoc－OSu）為熒光衍生化試劑，建立了柱前熒光衍生化反相高效液相色譜法分析去甲烏藥堿的高靈敏分析方法．在硼酸緩沖溶液（p H＝8．5）中，去甲烏藥堿與Fmoc－OSu在溫和的反應(yīng)條件下反應(yīng)生成具有熒光性的去甲烏藥堿衍生物．采用UltimateR○XB－C18（5μm，150 mm×4．6 mm i．d．）色譜柱，用乙腈－水（體積分?jǐn)?shù)比為85∶15）等溶液強(qiáng)度洗脫，以λ＝265 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，λ＝315 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)去甲烏藥堿衍生物進(jìn)行了檢測(cè)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：去甲烏藥堿在0．05～20μg/m L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＝0．999 8），其最低檢出限（S/N＝3）為5．0 ng/m L，加標(biāo)回收率為94．1%～105．9%，RSD為2．74%（n＝5）．本方法靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高，能夠滿足含去甲烏藥堿中藥材的質(zhì)量控制．

去甲烏藥堿；柱前熒光衍生化；HPLC；Fmoc－OSu；蓮子心

去甲烏藥堿（higenamine，HG）是烏頭、附子、蓮子心等中藥中所含有的強(qiáng)心的有效成分．藥理實(shí)驗(yàn)表明，去甲烏藥堿對(duì)心血管系統(tǒng)有正力性和正時(shí)性效應(yīng)［1］，其特性類(lèi)似于多巴胺丁胺，有望成為一種新的臨床心肌負(fù)荷藥物．近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，去甲烏藥堿對(duì)iNOS m RNA的表達(dá)、脂多糖LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)物以及對(duì)血小板聚集和血栓形成都具有抑制作用，而且對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性DIC也具有改善作用［2］．目前，去甲烏藥堿的常用測(cè)定方法有HPLC－UV［3］、HPLC－ECD［4］、HPLC－ESI－MS［5］、HPLC－FLD［6］等，其中HPLC－UV方法檢測(cè)靈敏度較低，不適于含微量去甲烏藥堿試樣的分析；HPLC－ECD和HPLC－ESI－MS方法檢測(cè)靈敏度雖然較高，但由于ECD和MS檢測(cè)器較為昂貴，因此限制了其廣泛的應(yīng)用．本文研究者曾用手性熒光衍生化試劑建立了分離去甲烏藥堿對(duì)映體的HPLC－FLD［7］方法．本文以9－芴甲基－N－琥珀酰亞胺基碳酸酯（Fmoc－OSu）為熒光衍生化試劑，用HPLC－FLD建立了去甲烏藥堿的測(cè)定方法，并用此方法測(cè)定了蓮子心中去甲烏藥堿的含量．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

儀器有Shimadzu LC－10AVP高效液相色譜儀（日本島津公司），RF－10AXL熒光檢測(cè)器，Class－VP色譜工作站，AS20500A超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），HB－100恒溫金屬?。ê贾荽蠛蜔犭娮佑邢薰荆?/p>

去甲烏藥堿（純度大于97%）由江西中藥研究所提供，F(xiàn)moc－OSu（純度大于98%）購(gòu)于J＆K CHEMICAL LTD，乙腈、甲醇為色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），氫氧化鉀、氯化鉀為優(yōu)級(jí)純，硼酸為分析純?cè)噭?/p>

配制1mg/m L的去甲烏藥堿和5 mmol/L的Fmoc－OSu，于冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)前稀釋到所需濃度；用0．2 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)硼酸緩沖溶液p H值至8．5．

1．2 衍生化反應(yīng)

分別取一定濃度的去甲烏藥堿標(biāo)準(zhǔn)溶液、Fmoc－OSu乙腈溶液（待測(cè)物濃度的125倍）和硼酸緩沖溶液（p H＝8．5）各10μL混合于聚丙烯管中，用渦旋攪拌器攪拌1 min，在室溫下反應(yīng)50 min．

1．3 樣品前處理

將蓮子心研磨成粉末，精確稱(chēng)取蓮子心粉末2．50 g放入100 m L錐形瓶中，加入25 m L甲醇，在超聲波清洗器中超聲30 min（50℃下），過(guò)濾．上述操作重復(fù)進(jìn)行3次，合并濾液．將濾液在45℃下減壓蒸餾濃縮旋至近干，用乙腈－水（體積分?jǐn)?shù)比為1∶1）定容至25 m L．經(jīng)0．45μm微孔濾膜過(guò)濾，取1 m L濾液用水定容至200 m L．

1．4 色譜條件

采 用UltimateR○XB－C18（5μm，150 mm×4．6 mm i．d．）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈－水（體積分?jǐn)?shù)比為85∶15），柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μL；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)為λex＝265 nm，λem＝315 nm．

2 結(jié)果與討論

2．1 衍生化反應(yīng)條件

Fmoc－OSu作為一種柱前衍生化試劑，具有過(guò)量的衍生化試劑不干擾分離、其衍生物穩(wěn)定性較好、基體干擾不明顯、衍生選擇性較好等［7］特點(diǎn)，已用于氨基酸、多肽的分離分析．因此，本研究以Fmoc－OSu作為分離分析去甲烏藥堿的衍生化試劑．圖1為去甲烏藥堿與Fmoc－OSu的衍生化反應(yīng)式．

圖1 去甲烏藥堿與Fmoc－OSu的衍生化反應(yīng)式

影響去甲烏藥堿與Fmoc－OSu衍生化反應(yīng)的因素有反應(yīng)介質(zhì)的酸度、反應(yīng)時(shí)間、衍生化試劑的濃度等．首先，根據(jù)文獻(xiàn)［7］以硼酸緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)，探討緩沖溶液的p H值對(duì)衍生化效率的影響．從圖2可知，硼酸緩沖溶液的p H值為8．5時(shí)去甲烏藥堿衍生物的峰面積最大，所以本實(shí)驗(yàn)將p H值為8．5的硼酸緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)．其次，在室溫條件下，觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生化反應(yīng)的影響．圖3顯示，反應(yīng)開(kāi)始時(shí)去甲烏藥堿衍生物的峰面積隨反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，衍生物的峰面積最大且趨于恒定，因此衍生化反應(yīng)時(shí)間選為50 min．最后，考察衍生化試劑濃度對(duì)衍生化反應(yīng)的影響．實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于濃度為0．04μmol/m L的去甲烏藥堿，F(xiàn)moc－OSu的濃度為5μmol/m L（衍生化試劑濃度/去甲烏藥堿濃度＝125）時(shí)，衍生物的峰面積最大且趨于恒定，所以將衍生化試劑的比選定為125（Fmoc－OSu濃度/去甲烏藥堿濃度）．

圖2 硼酸緩沖溶液p H值對(duì)衍生化反應(yīng)的影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生化反應(yīng)的影響

2．2 檢測(cè)波長(zhǎng)及色譜條件

以λ＝265 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，λ＝315 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)去甲烏藥堿衍生物進(jìn)行檢測(cè)．采用UltimateR○XB－C18（5μm，150 mm×4．6 mm i．d．）色譜柱，進(jìn)行衍生化反應(yīng)液中去甲烏藥堿衍生物的分離．在甲醇－水、乙腈－水、磷酸鹽緩沖液（p H＝3．0）－乙腈、磷酸二氫鈉（p H＝3．0）－乙腈等洗脫液中，當(dāng)以乙腈－水（體積分?jǐn)?shù)比為85∶15）作為流動(dòng)相，流速為1 m L/min時(shí)，去甲烏藥堿衍生物與基質(zhì)中的其他峰得到了很好的分離（見(jiàn)圖4）．根據(jù)與空白和樣品色譜圖的比較，確定保留時(shí)間為13．6 min的峰為去甲烏藥堿衍生物，其他峰為過(guò)量Fmoc－OSu和反應(yīng)副產(chǎn)物．

圖4 去甲烏藥堿與過(guò)量Fmoc－OSu衍生化反應(yīng)后的色譜圖：a為Fmoc－OSu（空白），b為HG－Fmoc－OSu衍生物

2．3 線性關(guān)系和檢出限

去甲烏藥堿在0．05～20μg/m L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系 （r＝0．999 8），其回歸線性方程為Y＝1．181 76×106X＋18 320．427 25（Y為去甲烏藥堿衍生物峰面積，X 為去甲烏藥堿濃度）．當(dāng)S/N＝3時(shí)，檢出限為5．0 ng/m L，比HPLCUV［3］方法高10倍．

2．4 精密度和穩(wěn)定性

將濃度為10μg/m L的去甲烏藥堿標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后，同1天連續(xù)進(jìn)樣5次，置于冰箱（4℃）中的衍生化產(chǎn)物連續(xù)5 d進(jìn)樣．結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度和日間精密度分別為2．74%和9．14%．

2．5 加標(biāo)回收率

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)分析方法進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證．取1．25 g蓮子心粉末6份，分別加入1．2 mg去甲烏藥堿標(biāo)樣，考察樣品的加標(biāo)回收率．結(jié)果顯示，樣品的回收率為88．3%～112．5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5．8%～8．4%（n＝5）．

2．6 蓮子心中去甲烏藥堿含量的測(cè)定

利用本方法測(cè)定蓮子心中的去甲烏藥堿含量．蓮子心提取液的衍生化色譜圖見(jiàn)圖5．在色譜圖中，實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間為13．69 min的峰是去甲烏藥堿衍生物，其含量測(cè)定結(jié)果為94．0 mg/100 g．

圖5 蓮子心提取液的衍生化色譜圖

3 結(jié)論

研究了HPLC－FLD分離去甲烏藥堿的Fmoc－OSu柱前衍生化條件和色譜條件．使用該方法可使衍生化反應(yīng)定量地進(jìn)行，其反應(yīng)條件溫和，衍生化產(chǎn)物較穩(wěn)定，而且過(guò)量的衍生化試劑和副產(chǎn)物均不干擾待測(cè)物的分離和檢測(cè)．該方法選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，可用于含去甲烏藥堿的中藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制．

［1］ Kosuge T，Yokota M．Studies on cardiac principle of aconite root［J］．Chem Pharm Bull（Tokyo），1976，24：176－178．

［2］ 周素娟，杜貴友．去甲烏藥堿對(duì)心血管系統(tǒng)的影響［J］．中國(guó)中藥雜志，2003，28（10）：910－913．

［3］ 陳寶玲，鄭英麗，陸直，等．HPLC法測(cè)定去甲烏藥堿的含量［J］．中國(guó)新藥雜志，2004，13（7）：628－630．

［4］ Lo C F，Chen C M．Determination of higenamine in plasma and urine by high performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］．J Chromatogr B，1994，655：33－39．

［5］ Feng S，Hu P，Jiang J．Determination of higenamine in human plasma and urine using liquid chromatography coupled to positive electrospray ionization tandem mass pectrometry［J］．J Chromatogr B，2011，879：763－768．

［6］ 丁雅韻，謝孟峽．Fmoc－OSu作為液相色譜分離分析氨基酸的柱前衍生試劑研究［J］．分析實(shí)驗(yàn)室，2001，20（Suppl）：138－139．

［7］ Hong H，Lee Y I，Jin D．Determination of R－（＋）－h(huán)igenamine enantiomer in Nelumbo nucifera by highperformance liquid chromatography with a fluorescent chiral tagging reagent［J］．Microchemcal J，2010，96：374－379．

Determination of higenamine in Nelumbo nucifera by HPLC with precolumn derivatization

TIAN Hai－feng1， YI Tao2， JIN Dong－ri1＊
（1．Department of Chemistry，College of Science，Yanbian University，Yanji 133002，China；2．JILin Tobacco Industrial Co．，LTD，Yanji 133001，China）

A sensitive method for determination of higenamine based on a derivatization reaction with a fluorescent tagging reagent，9－fluorenylmethoxycarbonylsuccinimide（Fmoc－OSu）is developed．The Fmoc－OSu preferably reacts with higenamine under mild reaction conditions in the presence of borate buffer（p H＝8．5）to produce the corresponding fluorescent derivative with an excitation maximum at 265 nm and an emission maximum at 315 nm．The derivative of higenamine are efficiently resolved on a UltimateR○XB－C18（5μm，150 mm×4．6 mm i．d．）column by an isocratic elution with water－acetonitrile（85∶15）mobile phase．The linear range is 0．05－20μg/m L（r＝0．999 8）for higenamine．The average recovery of the higenamine is 94．1%－105．9%（RSD 2．74%）．The limits of detection（S/N＝3）per injection is 5．0 ng/m L．The developed method is applied successfully to the determination of higenamine in embryo of Nelumbo nucifera，a Chinese herbal medicine．

higenamine；precolumn derivatization method；HPLC；Fmoc－OSu；Nelumbo nucifera

O657．72

A

1004－4353（2012）02－0150－04

2012－01－20

＊通信作者：金東日（1965—），男，教授，研究方向?yàn)樗幬锓治觯?/p>