蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱的研制與鑒定

朱立鑫，裘雪梅，陳興龍，劉仁榮,*，徐 玲，徐富勇

(1.江西科技師范學院生命科學學院，江西 南昌 330013；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047)

蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱的研制與鑒定

朱立鑫1,2，裘雪梅1，陳興龍1,2，劉仁榮1,*，徐 玲1，徐富勇1,2

(1.江西科技師范學院生命科學學院，江西 南昌 330013；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047)

以羧基化的瓊脂糖凝膠4FF為載體，采用碳化二亞胺法偶聯(lián)抗蘇丹紅Ⅰ(SudanⅠ)單克隆抗體，制備蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱(IAC)。將SudanⅠ樣品過免疫親和柱，乙腈洗脫后以高效液相色譜法(HPLC)檢測，紫外檢測波長為478nm，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈-0.1%甲酸乙腈溶液-丙酮(體積比為21.25:3.75:60:15)?？筍udanⅠ單克隆抗體免疫親和柱以0.3g帶羧基的瓊脂糖凝膠4FF與1mg SudanⅠ單抗偶聯(lián)，柱容量為1.6μg。辣椒粉以0.25～3mg/kg水平添加SudanⅠ標準品，平均回收率為44.52%～77.40%，相對標準偏差為4.6%～8.3%。信噪比(RSN)為3:1時的最低檢測限為15ng/mL。本實驗成功制備出蘇丹紅免疫親和柱。

蘇丹紅；免疫親和柱；高效液相色譜

蘇丹紅Ⅰ(SudanⅠ)是人工合成的屬于非離子型脂溶性偶氮類化合物中的一種有機染色劑[1]，由于其價格低廉，染色效果好，常被廣泛地應用于工業(yè)產(chǎn)品中[2-3]。動物實驗表明蘇丹紅Ⅰ具有潛在的致癌性，能導致膀胱、肝臟、脾臟等器官腫瘤[4-5]，被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)歸為3類致癌物，已被禁止作為食品添加劑使用[6-9]。

目前，各國學者建立了多種檢測蘇丹紅Ⅰ的方法，主要有酶聯(lián)免疫吸附實驗法(ELISA)[7-10]、液相色譜法(LC-UV-VIS)[11]和液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[5]。還有一些方法，如毛細管膠束電泳色譜法聯(lián)紫外檢測器法(MEKC-UV)[2]、液相色譜電噴霧聯(lián)質(zhì)譜儀法(LC-ESI-MS)[12]、分子印跡聚合物的固相萃取聯(lián)高效液相色譜法(MIP-SPE-HPLC)[13]、高效液相色譜聯(lián)電化學法(HPLC-EC)[14]、電化學法(CPE)[15]和毛細管液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿加速飛行時間質(zhì)譜(CLC-ES-QO-MS)[16]等，ELISA法檢測蘇丹紅的最低檢測限小于1ng/mL，HPLC法的最低檢測限小于10μg/kg，LC-MS法的最低檢測限小于10μg/L。ELISA法快速、靈敏，對樣品純度要求低，但干擾因素多，重復性差，常用于大批量樣品的檢測[17]；EC檢測法靈敏度較差；HPLC、LC-MS、LC-MS/MS靈敏、準確，但對樣品純度要求較高，檢測前必須對樣品進行凈化處理，常規(guī)凈化法步驟繁雜，且需使用大量有機溶劑，危害操作人員的身體健康。免疫親和柱凈化法是利用抗原抗體高度特異性親和吸附作用，使固定在載體上的抗體能快速特異地將蘇丹紅Ⅰ從樣品中分離，并同時完成凈化和濃縮步驟。

本實驗以羧基化的瓊脂糖凝膠4FF為載體，制備蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱，并凈化加標樣品，通過HPLC-UV對凈化效果進行鑒定。免疫親和柱簡便、快速、高效的樣品前處理方式，為HPLC、MS等精確檢測各種樣品提供了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉 市售；抗SudanⅠ單克隆抗體小鼠腹水、羧基化的Sepharose 4FF 實驗室自制。

SudanⅠ、碳化亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl) 美國Sigma公司；乙腈、甲醇(色譜純) 上海陸都化學試劑廠；丙酮(色譜純) 汕頭市西隴化工廠有限公司；實驗用水為Millipore制備的超純水。

PBS緩沖液： NaCl 8.0g、 Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO40.2g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。

1.2 儀器與設備

5804R離心機 德國Eppendorf公司；Lambda 35紫外分光光度計 Perkin Elmer公司；PowerPac Basic Power Supply蛋白質(zhì)電泳儀 美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Agilent 1100高效液相色譜 美國安捷倫公司；超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 SudanⅠHPLC檢測方法的建立[18]

HPLC條件：C18反相色譜柱ODS Hypersil (2.1mm×100mm，5μm)；進樣量：20μL；流速：1mL/min；柱溫：30℃；紫外檢測器：478nm；流動相：A相、B相體積比25:75 (A：0.1%甲酸的水溶液、乙腈體積比85:15，B：0.1%甲酸的乙腈溶液、丙酮體積比80:20)。

SudanⅠHPLC檢測方法的標準曲線繪制：20μL不同質(zhì)量濃度的SudanⅠ標準溶液(先用N,N-二甲基甲酰胺配成1mg/mL，然后用乙腈稀釋成4000、3000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25ng/mL)用 HPLC檢測，每個質(zhì)量濃度重復進樣3次，根據(jù)峰面積繪制標準曲線。以RSN為3:1時的蘇丹紅質(zhì)量濃度作為最低檢測限。

1.3.2 抗SudanⅠ單克隆抗體小鼠腹水的制備[17]、純化和鑒定[19-20]

抗SudanⅠ單克隆抗體小鼠腹水的制備參考文獻[17]，其純化和鑒定參考[19-20]方法進行。

1.3.3 抗SudanⅠ單克隆抗體瓊脂糖凝膠4FF的制備

將羧基化的的瓊脂糖凝膠4FF置于砂芯漏斗中，用蒸餾水沖洗，真空泵抽干，稱取1g，加入1mg抗SudanⅠ單抗、EDAC和超純水，于室溫，180r/min振蕩反應12h。以此同時，用氨基化蘇丹紅與抗SudanⅠ單抗做對照，觀察反應偶聯(lián)效果。然后再加入pH 8.0 0.1mol/L Tris-HCl封阻緩沖液，繼續(xù)反應3h。

將偶聯(lián)有單抗的瓊脂糖凝膠4FF，先用PBS洗3次，然后用pH 3.6 0.1mol/L醋酸緩沖液含0.5mol/L NaCl和pH 8.0、0.1mol/L Tris-HCl緩沖液含0.5mol/L NaCl交替洗至少3次，再用PBS洗3次，最后用0.2g/L NaN3的PBS洗2次，將凝膠保存于4℃，0.2g/L NaN3的PBS中。

將偶聯(lián)有氨基化蘇丹紅的瓊脂糖凝膠4FF，先用0.01mol/L HCl洗至少3次，每次振蕩混勻，以1000r/min離心3min，棄上清；再用乙腈和PBS緩沖液分別洗3次，方法同上。然后，將其加入PB S緩沖液，4℃保存。

1.3.4 免疫親和柱凈化樣品

將保存于4℃、0.2g/L NaN3-PBS中的抗SudanⅠ單抗-Sepharose 4FF平衡至室溫后脫氣，裝柱后，先用PBS緩沖液平衡；然后以20%乙腈-PBS作為上樣緩沖液，上樣一次；再用PBS緩沖液清洗至少10倍柱床體積，以1滴1～2s速度過柱；最后用3.0mL乙腈洗脫，收集洗脫液。立即將柱子用PBS緩沖液清洗至少3次，然后用pH 3.6、0.1mol/L醋酸緩沖液含0.5mol/L NaCl和pH 8.0、0.1mol/L Tris-HCl緩沖液含0.5mol/L NaCl交替洗至少3次，再用PBS緩沖液洗3次，將凝膠保存于4℃、0.2g/L NaN3的PBS中。

1.3.5 免疫親和柱性能的測定和IAC條件的優(yōu)化

1.3.5.1 上樣緩沖液的選擇

取0.3g 抗SudanⅠ單抗-Sepharose 4FF裝柱，共3批，每批4支，同時上樣1.8μg SudanⅠ標準品，上樣緩沖液分別為8mL 15%、20%、25%、30%乙腈-PBS，3.0mL乙腈洗脫，HPLC檢測洗脫液。

1.3.5.2 洗脫液體積的選擇

取抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF親和柱6支(共3批，每批6支)，同時上樣，上樣量為1.8μg SudanⅠ標準品，然后分別用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL乙腈洗脫，收集洗脫液，并用HPLC檢測。

1.3.5.3 免疫親和填料裝柱量、上樣量與柱容量的關系

填料裝柱量與柱容量的關系：取1支柱子(共3批，每批1支)，用0.6g 抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，上樣量為1.8μg SudanⅠ標準品，用3.0mL乙腈洗脫并吹干，收集洗脫液，用HPLC檢測。

上樣量與柱容量的關系：取0.3g抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，4支(共3批，每批4支)，上樣量分別為1、2、3、4μg SudanⅠ標準品，用3.0mL乙腈洗脫，分別收集洗脫液，并用HPLC檢測。

柱容量的測定：取1支柱子(共3批，每批1支)，用0.3g 抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，上樣量為1.8μg SudanⅠ標準品，用3.0mL乙腈洗脫，收集洗脫液，并用HPLC檢測。

1.3.5.4 免疫親和柱穩(wěn)定性的測定

洗脫液對免疫親和柱的影響：取0.3g 抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，上樣量為1.8μg SudanⅠ標準品，洗脫并收集洗脫液。柱子平衡和再生后，再重復以上步驟兩次。用HPLC檢測洗脫液。

1.3.6 辣椒粉樣品加標回收率實驗

稱取1g辣椒粉陰性樣品(經(jīng)HPLC和ELISA法檢測都為陰性)，分別加入250、500、1000、2000、3000ng SudanⅠ標準品，每個濃度做3個平行樣；加入5mL乙腈，然后振蕩(或超聲)10min，離心15min，取上清3.6mL濃縮至1mL左右，接著再用乙腈定容至1.6mL，再加6.4mL PBS，混勻后，用定性濾紙過濾。然后取濾液6.6mL過免疫親和柱(每支用0.3g抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱，柱容量約為1000ng)。

2 結果與分析

2.1 SudanⅠHPLC檢測方法的建立

在本實驗條件下，SudanⅠ的HPLC保留時間為7.973min，如圖1所示。

圖1 4000ng/mL SudanⅠ標品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Sudan I standard at 4000 ng/mL

分析不同質(zhì)量濃度的標準溶液HPLC檢測結果，在質(zhì)量濃度為31.25～4000ng/mL時，峰面積與SudanⅠ質(zhì)量濃度呈線性關系，且標準曲線方程為y＝0.07422.6395(R2＝0.9998)。該方法的最低檢測限為15ng/mL(RSN＝ 3:1)。

2.2 小鼠腹水中SudanⅠ單抗純化效果的評價

2.2.1 辛酸-硫酸銨法純化腹水中單抗的回收率

使用紫外分光光度計紫外掃描小鼠腹水和腹水純化后抗體中蛋白質(zhì)量濃度分別為27.29mg/mL和7.17mg/mL，它們體積分別為4.0mL和4.05mL，蛋白回收率為26.60%。

2.2.2 抗SudanⅠ單克隆抗體純度的測定

圖2 抗SudanⅠ單克隆抗體純化前后SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE pattern of ascites and purified anti-Sudan I monoclonal antibody

由圖2可知，原始腹水的蛋白成分復雜，經(jīng)純化后的抗體蛋白較單一，說明抗體純度較高。

2.2.3 純化后抗SudanⅠ單抗活性的測定

采用間接非競爭ELISA，以BSA-SudanⅠ3μg/mL為檢測抗原包被，原始腹水和純化后抗體在相同比例稀釋下，在光密度值為1.2時，原始腹水和純化后的單抗效價分別為1:1.28×105、1:6.4×104，對比可知，單抗純化的活性回收率較高。

2.3 抗SudanⅠ單克隆抗體免疫親和柱的制備

氨基化蘇丹紅和抗SudanⅠ單克隆抗體在相同的條件下分別與羧基化的瓊脂糖凝膠4FF反應，若氨基化蘇丹紅偶聯(lián)效果很好，說明在此條件下偶聯(lián)上的單抗量也較多。

偶聯(lián)有氨基化蘇丹紅的羧基化瓊脂糖凝膠4FF，經(jīng)洗凈后，由凝膠顏色的深淺可看出，在EDAC終質(zhì)量濃度為19mg/mL，17℃、180r/min振蕩反應12h時偶聯(lián)效果好。

2.4 免疫親和柱性能的測定和IAC條件的優(yōu)化

2.4.1 上樣緩沖液和上樣方式的選擇

SudanⅠ難溶于水，為增加其溶解量，用乙腈等有機溶劑溶解，但有機溶劑又會破壞單抗的活性，因此需探尋上樣緩沖液中乙腈比例與SudanⅠ回收率的關系，盡可能地使SudanⅠ與固定的單抗結合，其關系，如圖3所示，上樣緩沖液為20%乙腈-PBS時，SudanⅠ回收率最大。

圖3 上樣緩沖液與SudanⅠ回收率的關系Fig. 3 Effect of loading buffer concentration on recovery rate of Sudan I

2.4.2 洗脫液體積的選擇

取0.3g抗SudanⅠ單抗的Sepharose 4FF裝柱量，上樣量為1.8μg SudanⅠ，SudanⅠ回收率與乙腈洗脫液關系。如圖4所示，SudanⅠ回收率在洗脫液乙腈的體積從0.5～1.0mL時，出現(xiàn)劇增，從1.0～3.0mL時，增幅較小。故本實驗選擇3.0mL乙腈作為洗脫液。

圖4 洗脫液體積與SudanⅠ洗脫率的關系Fig. 4 Effect of eluent dose on elution rate of Sudan I

2.4.3 免疫親和柱填料裝柱量、上樣量與柱容量的關系

免疫親和柱填料裝柱量與柱容量的關系：0.6g抗SudanⅠ單抗-Sepharose 4FF，上樣量為2 μg SudanⅠ時，1mL乙腈洗脫，SudanⅠ回收率為43.93%，比裝柱量為0.3g的回收率低。原因是裝柱量增大，增加柱床高度，從而也增加了SudanⅠ吸附距離，在洗脫液體積為1.0mL時，并不能完全把結合上的SudanⅠ洗脫，最終導致低于0.3g裝柱量的回收率。

上樣量與柱容量關系：同批免疫親和填料0.3g，僅上樣量不同，用3mL乙腈洗脫后，經(jīng)HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)上樣量和柱容量的關系。柱容量的測定：0.3g免疫親和填料，在優(yōu)化條件下，即SudanⅠ上樣量為1.8μg，20%的乙腈-PBS作為上樣緩沖液，僅上樣一次，測得柱容量為1582.8ng，SudanⅠ回收率為87.93%。由圖5可知，在3mL乙腈洗脫下，SudanⅠ上樣量達到2μg時，再增加上樣量，測出的柱容量基本上保持穩(wěn)定。

圖5 SudanⅠ上樣量與柱容量的關系Fig. 5 Effect of loading amount of Sudan I on IAC capacity

2.4.4 免疫親和柱穩(wěn)定性的測定

免疫親和柱每次上樣量為1.8μg，僅上樣一次，上樣緩沖液為25%乙腈-PBS，3.0mL乙腈作為洗脫液。第一次上樣，清洗，洗脫后，立即再生，接著重復此步驟兩次，以消除保存方法和保存時間對免疫親和填料的影響，考察洗脫液對免疫親和填料中單抗的破壞程度。如圖6所示，每使用一次，SudanⅠ回收率約降低12%，即柱容量降低216ng，說明免疫親和柱穩(wěn)定性較好，可以重復使用。

圖6 免疫親和柱穩(wěn)定性與SudanⅠ回收率的關系Fig. 6 Effect of number of repeated uses on recovery rate of Sudan I

2.5 辣椒粉樣品加標回收率實驗

表1 辣椒粉樣品SudanⅠ標品加標回收實驗Table 1 Recovery rates of Sudan I in chili powder samples spiked with Sudan I standard

選用柱容量約為1000ng的免疫親和柱進行樣品加標回收實驗。將加有不同量SudanⅠ標準品的辣椒粉樣品，經(jīng)乙腈提取并用PBS緩沖液稀釋至20%乙腈-PBS后，過免疫親和柱，用建立的HPLC法檢測洗脫液中SudanⅠ的含量，由表1可知，測得辣椒粉中SudanⅠ的回收率為44.52%～77.40%，變異系數(shù)為4.6%～8.3%，表明蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱研制成功。

3 討 論

采用碳化亞二胺法，以本實驗室制備的羧基化瓊脂糖凝膠4FF為載體與抗蘇丹紅Ⅰ單抗偶聯(lián)，成功地制備了蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱。免疫親和柱柱容量約為1600ng。通過樣品加標回收實驗表明，在加標量未超過柱容量時，蘇丹紅Ⅰ回收率大于70%，最低檢測限為15ng/mL(RSN＝3:1)。蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱經(jīng)多次使用后，蘇丹紅Ⅰ回收率每次降低12%，說明免疫親和柱基本穩(wěn)定，能重復利用。由于羧基化瓊脂糖凝膠的制備和辛酸-硫酸銨法純化的單抗，不同批次有所差別，使免疫親和柱柱容量在微小范圍內(nèi)波動，但蘇丹紅Ⅰ回收率幾乎不變。蘇丹紅的物理吸附性強，易吸附于免疫親和柱的篩板和柱壁上，且上樣量大時，吸附上的蘇丹紅也相應的增多，吸附的蘇丹紅經(jīng)有機溶劑和超聲處理仍難以洗脫，導致實際上樣量偏低，從而使回收率遠低于真實值。因此，羧基化瓊脂糖凝膠4FF活化率的提高，單抗的偶聯(lián)條件和蘇丹紅上樣條件(上樣緩沖液的鹽濃度和pH值、上樣體積、洗脫速度、溫度)的進一步優(yōu)化，增加蘇丹紅結合率降低物理性吸附率，以及制備高親和力的抗蘇丹紅Ⅰ單抗，為增大柱容量、提高蘇丹紅回收率提供可能。

目前，國內(nèi)外均無抗蘇丹紅免疫親和柱研制的報導，本實驗成功制備的抗蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱填補了這份空白。免疫親和柱特異性強、簡便快速、安全、回收率高的樣品凈化處理方式，為高效液相色譜-質(zhì)譜儀準確、快速地檢測各種蘇丹紅樣品提供了良好的基礎，顯示了很好的應用前景。

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Preparation and Identification of Sudan I Immunoaffinity Column

ZHU Li-xin1,2，QIU Xue-mei1，CHEN Xing-long1,2，LIU Ren-rong1,*，XU Ling1，XU Fu-yong1,2
(1. College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China ；2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

A Sudan I immunoaffinity chromatographic column (IAC) was prepared by carbodiimide method, in which a modified Sepharose 4FF containing carboxyl group was used as the carrier to couple with a monoclonal antibody against Sudan I. A reversed-phase HPLC method was established to determine Sudan I using a mobile phase composed of 0.1% formic wateracetonitrile-0.1% formic acetonitrile-acetone (21.25:3.75:60:15, V/V) at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was 478 nm. The retention time of Sudan I was found to be 7.97 min. The prepared IAC column as a conjugate between 0.3 g of Sepharose 4FF and 1 mg of purified anti-Sudan I monoclonal antibody showed a capacity of 1.6μ g. The average recovery rates of Sudan I from chili powder spiked with Sudan I standard at levels varying from 0.25 to 3 mg/kg was 44.52%～77.40% with relative standard deviation of 4.6%～8.3%. The detection limit was 15 ng/mL based on a signal-to-noise ratio of 3:1. Therefore, a Sudan I IAC column has been prepared successfully.

Sudan I；immunoaffinity column；high performance liquid chromatography (HPLC)

O658；TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0252-05

2011-06-02

江西省教育廳科技專項(GJJ10595)

朱立鑫(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhulixin007@163.com

*通信作者：劉仁榮(1969—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：lilirenrong@hotmail.com