唐曉芳，張國棟，*，王 剛

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川成都611130）

Hansenula anomala轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)阿拉伯糖醇的研究

唐曉芳1，張國棟1，*，王 剛2

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川成都611130）

對(duì)Hansenula anomala轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的反應(yīng)條件進(jìn)行了研究。高供氧量有利于阿拉伯糖醇的生成。在一定范圍內(nèi)，葡萄糖初始濃度越高，阿拉伯糖醇的產(chǎn)量也隨之明顯提高。并通過正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳發(fā)酵條件為（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；發(fā)酵溫度30℃，裝液量15～20mL/500mL三角瓶，發(fā)酵時(shí)間263h。阿拉伯糖醇濃度為245.97g/L，轉(zhuǎn)化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應(yīng)強(qiáng)度0.935g/Lh。

異常漢遜氏酵母（Hansenula anomala），D-阿拉伯糖醇，發(fā)酵

D-阿拉伯糖醇（D-Arabitol），是一種功能性食品添加劑，由于其可作為低熱量、非齲齒甜味劑而備受關(guān)注，此外，它也是許多有應(yīng)用價(jià)值的藥物中間體[1]，具有很大的研究和應(yīng)用價(jià)值。由于這種五碳多元醇有多種同分異構(gòu)體存在，導(dǎo)致化學(xué)方法合成十分困難。在高滲透壓環(huán)境中（高鹽或高糖含量），耐高滲透壓酵母菌會(huì)在細(xì)胞內(nèi)累積產(chǎn)生多元醇。這些多元醇，特別是甘油和阿拉伯糖醇，能對(duì)細(xì)胞起到協(xié)調(diào)細(xì)胞功能和滲透調(diào)節(jié)作用，所以叫做穩(wěn)定溶質(zhì)（compatible solute）[2-5]。轉(zhuǎn)化葡萄糖形成阿拉伯糖醇，是由于酵母細(xì)胞在高的葡萄糖濃度下，會(huì)增強(qiáng)磷酸戊糖途徑，產(chǎn)生充足的有利于細(xì)胞生長和合成的NADPH。通過NADP+再生，從而形成阿拉伯糖醇。也就是說，阿拉伯糖醇經(jīng)由D-ribulose-5-phosphate脫磷酸，然后在D-阿拉伯糖醇脫氫酶催化下形成。反應(yīng)需要NADPH參與完成。能夠轉(zhuǎn)化葡萄糖形成阿拉伯糖醇的酵母菌有Saccharomyces、Debaryomyces、Hansenula、Pichia和Candida[3，6]。目前對(duì)阿拉伯糖醇的研究報(bào)道還很少。蔡莉等從含糖量高的自然界樣品中分離產(chǎn)阿拉伯糖醇的菌株，獲得1株產(chǎn)量較高的耐高滲酵母[7]。張麗麗等利用漢遜德巴利酵母發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，研究了影響其發(fā)酵的因素和最佳發(fā)酵條件[8]。本實(shí)驗(yàn)研究了Hansenula anomala轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的影響因素，并摸索有利于阿拉伯糖醇形成的條件，為大規(guī)模生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇提供有益的指導(dǎo)和幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Hansenula anomala strain GA24 中國科學(xué)院微生物所保存；斜面與平板培養(yǎng)基 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖300g，酵母膏5g，蛋白胨5g，pH 5.0；發(fā)酵培養(yǎng)基 除了實(shí)驗(yàn)中另行說明外，均與種子培養(yǎng)基相同，上述培養(yǎng)基均采用112.6℃滅菌30min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)與發(fā)酵條件 種子培養(yǎng)：500mL三角瓶裝入50mL培養(yǎng)液，接入試管斜面菌體1環(huán)，30℃、220r/min搖床培養(yǎng)48h。發(fā)酵培養(yǎng)：500mL三角瓶，裝液量根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。接入種子液，接種量5%。30℃、220r/min搖床培養(yǎng)，隔時(shí)取樣分析。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 細(xì)胞量測(cè)定 分光光度計(jì)測(cè)量OD650來表示細(xì)胞濃度。

1.2.2.2 葡萄糖含量測(cè)定 采用SBA-40型谷氨酸（乳酸）-葡萄糖雙功能分析儀。

1.2.2.3 阿拉伯糖醇和甘油濃度采用HPLC測(cè)定 樣品經(jīng)過12000r/min離心5min，除去菌體和雜質(zhì)。HPLC檢測(cè)條件為：色譜柱HPX-87H，柱溫45℃，流動(dòng)相8mmol/L H2SO4，流速0.5mL/min，檢測(cè)器RI@8x，進(jìn)樣量10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿拉伯糖醇發(fā)酵時(shí)間曲線和規(guī)律

圖1為阿拉伯糖醇發(fā)酵隨時(shí)間變化曲線。從圖中可看出，隨著時(shí)間的進(jìn)行，葡萄糖濃度逐步降低，而阿拉伯糖醇、甘油的含量以及細(xì)胞量則逐步升高，在葡萄糖消耗完畢時(shí)，阿拉伯糖醇、甘油的含量以及細(xì)胞量都達(dá)到最大。

圖1 阿拉伯糖醇濃度隨發(fā)酵時(shí)間關(guān)系曲線Fig.1 Relationship of D-Arabitol concentration and fermentation time

為了進(jìn)一步探明阿拉伯糖醇生成的規(guī)律，特別是發(fā)酵后期，葡萄糖消耗完畢后阿拉伯糖醇的濃度變化，采用如下發(fā)酵條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0，裝液量20mL/500mL三角瓶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、圖3。

在圖2中可看到，從發(fā)酵時(shí)間達(dá)到119h開始，此時(shí)葡萄糖已經(jīng)消耗完畢，而阿拉伯糖醇的濃度卻開始迅速增大，直到263h達(dá)到最大值245.97g/L，轉(zhuǎn)化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應(yīng)強(qiáng)度0.935g/L·h。

由于葡萄糖已經(jīng)消耗為零，而其他營養(yǎng)物質(zhì)如酵母膏、蛋白胨以及無機(jī)鹽，經(jīng)過長時(shí)間的發(fā)酵，也幾乎沒有殘留。所以，在發(fā)酵后期這種阿拉伯糖醇迅速增加的現(xiàn)象，不可能是酵母細(xì)胞利用營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化的結(jié)果。唯一可行的解釋是，Hansenula anomala在高滲透壓環(huán)境中（高的葡萄糖含量），積累形成的大量胞內(nèi)物質(zhì)/阿拉伯糖醇和甘油，能對(duì)細(xì)胞起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用。而一旦外界環(huán)境中高滲物質(zhì)葡萄糖消耗殆盡，阿拉伯糖醇和甘油作為穩(wěn)定溶質(zhì)就失去在細(xì)胞中存在的基礎(chǔ)和意義，并從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移滲透，從而出現(xiàn)發(fā)酵后期這些物質(zhì)在培養(yǎng)液中濃度繼續(xù)增加的現(xiàn)象。

所以，在培養(yǎng)液中葡萄糖耗盡后，繼續(xù)對(duì)細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)是必要的，這有利于細(xì)胞內(nèi)阿拉伯糖醇的滲出，提高阿拉伯糖醇的產(chǎn)量和得率。

圖2 葡萄糖消耗完畢后阿拉伯糖醇濃度隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線Fig.2 Relationship of D-Arabitol concentration and fermentation time after the glucose consumed

圖3 葡萄糖消耗完畢后阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化率和平均反應(yīng)強(qiáng)度隨發(fā)酵時(shí)間變化規(guī)律Fig.3 Relationship of D-Arabitol production and fermentation time after the glucose consumed

2.2 裝液量對(duì)阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響

氧的供應(yīng)對(duì)阿拉伯糖醇的產(chǎn)生非常重要。資料報(bào)道認(rèn)為，高的氧供應(yīng)可以增強(qiáng)磷酸戊糖途徑，累積NADPH[6，9]。通過NADP+再生，形成阿拉伯糖醇。實(shí)驗(yàn)采用改變裝液量來摸索氧對(duì)阿拉伯糖醇產(chǎn)生的影響。

圖4 裝液量對(duì)阿拉伯糖醇、甘油產(chǎn)量以及細(xì)胞量的影響Fig.4 Effect of aeration rate upon D-Arabitol,glycerol and biomass yield

實(shí)驗(yàn)可得出，裝液量越少越有利于阿拉伯糖醇的轉(zhuǎn)化。同時(shí)，裝液量越少，細(xì)胞量也越大。在裝液量為15、20mL時(shí)，沒有產(chǎn)生甘油。在所有實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)甘油作為副產(chǎn)物，含量較少，但是遺憾的是，在實(shí)驗(yàn)條件下，它似乎沒有表現(xiàn)出產(chǎn)生的規(guī)律。

高的氧供應(yīng)有利于阿拉伯糖醇的形成，是由于增強(qiáng)了磷酸戊糖途徑的結(jié)果。此外，我們發(fā)現(xiàn)，所有的實(shí)驗(yàn)都顯示了這樣一個(gè)規(guī)律：細(xì)胞量大，阿拉伯糖醇的產(chǎn)量就高。而良好的供氧，正好有利于細(xì)胞的生長。所以，在另一方面，高的氧供應(yīng)可以促進(jìn)阿拉伯糖醇的產(chǎn)生，也正是因?yàn)槠淇梢源龠M(jìn)細(xì)胞生長的結(jié)果。

2.3 初始葡萄糖濃度對(duì)阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響

圖5 葡萄糖初始濃度對(duì)阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of initial glucose concentration on D-Arabitol yield

圖6 葡萄糖初始濃度對(duì)阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化率和平均反應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of initial glucose concentration on D-Arabitol production

圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，葡萄糖初始濃度越高，阿拉伯糖醇的產(chǎn)量也隨之明顯提高。細(xì)胞量在初始濃度為400g/L時(shí)達(dá)到最大，葡萄糖濃度升高到500g/L，則略有下降，說明葡萄糖初始濃度過高會(huì)對(duì)細(xì)胞生長有所抑制。在圖6中，隨著葡萄糖濃度的提高，平均反應(yīng)強(qiáng)度也逐步增大。當(dāng)葡萄糖濃度為400g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高。最終確定500g/L的葡萄糖初始濃度作為最佳發(fā)酵條件，雖然其轉(zhuǎn)化率不是最大，但是它的阿拉伯糖醇產(chǎn)量和平均反應(yīng)強(qiáng)度均是最好。

2.4 氮源和無機(jī)鹽對(duì)阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響

為進(jìn)一步研究氮源和無機(jī)鹽對(duì)阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響，獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，正交實(shí)驗(yàn)L8（27）被設(shè)計(jì)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化率（g阿拉伯糖醇/100g葡萄糖）作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交數(shù)據(jù)分析，同樣，把阿拉伯糖醇產(chǎn)量或者平均反應(yīng)強(qiáng)度作為數(shù)據(jù)分析將得到完全相同的結(jié)果。

表1 阿拉伯糖醇發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of L8（27）orthogonal test on DArabitol fermentation

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析來看，各因素的極差，與空白項(xiàng)相比，都較小，說明各單一因素對(duì)阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響不顯著。最佳因素水平為A2B1C1D1E1F1。但是，從表3則發(fā)現(xiàn)，酵母膏在水平1時(shí)結(jié)果更好，而且此時(shí)酵母膏用量低，節(jié)約成本。所以，確定最佳發(fā)酵條件為A1B1C1D1E1F1，即（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；發(fā)酵溫度30℃，裝液量15～20mL/500mL三角瓶，發(fā)酵時(shí)間263h，阿拉伯糖醇濃度245.97g/L，轉(zhuǎn)化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應(yīng)強(qiáng)度0.935g/L·h。

3 結(jié)論

表2 L8（27）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)處理Table 2 Result of L8（27）orthogonal test

表3 酵母膏與其他各因素的交互作用Table 3 Interaction of yeast extract and other factors

阿拉伯糖醇作為多元糖醇的一種，在機(jī)體內(nèi)的代謝與胰島素?zé)o關(guān)，同時(shí)又不是口腔微生物的適宜作用底物，所以食用不致牙齒齲變，而且大部分多元醇能量較低，因此是一類重要的功能性食品添加劑和基料。D-阿拉伯糖醇的應(yīng)用較廣泛。在食品領(lǐng)域，除用作新型高檔食品甜味劑外，還可改善酒精飲料的品質(zhì)、并可用做調(diào)制糖漿的基質(zhì)等。在醫(yī)藥領(lǐng)域，是合成一些神經(jīng)藥物的中間體。

本文應(yīng)用耐高滲酵母Hansenula anomala，轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，研究了發(fā)酵的主要影響因素和發(fā)酵條件。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中葡萄糖含量以及發(fā)酵過程中的溶氧對(duì)其發(fā)酵影響較大。提高發(fā)酵中的供氧，有利于阿拉伯糖醇的生成；同時(shí)，葡萄糖初始濃度越高，阿拉伯糖醇的產(chǎn)量也明顯提高。我們也對(duì)D-阿拉伯糖醇發(fā)酵的培養(yǎng)基配方進(jìn)行了研究，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件：在最佳培養(yǎng)基條件下，裝液量15～20mL/500mL三角瓶，30℃發(fā)酵時(shí)間263h，得到產(chǎn)物阿拉伯糖醇濃度為245.97g/L，轉(zhuǎn)化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應(yīng)強(qiáng)度0.935g/Lh。

[1]Hajny GJ.D-Arabitol production by Endomycopsis chodati [J].Appl Microbiol，1964，12：87-92.

[2]Da Costa MS，Niederpruem DJ.Arabitol Accumulation in Geotrichum candidium[J].Arch Microbiol，1982，131：283-286.

[3]Moran JW，Witter LD.Effect of Sugars on D-Arabitol Production and Glucose Metabolism in Saccharomyces rouxii[J]. J Bacteriol，1979，138：823-831.

[4]Nobre MF，Da Costa MS.Factors Favouring the Accumulation of Arabitol in the Yeast Debaryomyces hansenii[J].Can J Microbiol，1985，31：467-471.

[5]Da Costa MS，Niederpruem DJ.Temporal Accumulation of Mannitol and Arabitol in Geotrichum candidium[J].Arch Microbiol，1980，126：57-64.

[6]Ingram JM，Wood WA.Enzymatic Basis for D-Arabitol Production by Saccharomyces rouxii[J].J Bacteriol，1965，89：1186-1194.

[7]蔡莉，張揚(yáng)，朱宏陽，等.1株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的菌株的分離篩選及鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35：23-26.

[8]張麗麗，廖德芳，丁重陽，等.漢遜德巴利酵母發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇[J].工業(yè)微生物，2010，40（4）：47-52.

[9]Escalante J，Caminal G，F(xiàn)igueredo M，et al.Production of Arabitol from Glucose by Hansenula polymorpha[J].J Ferment. Bioeng，1990，70：228-231.

[10]賀鵬.細(xì)菌血紅蛋白基因vgb在產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌中的克隆與表達(dá)[D].北京：中國科學(xué)院微生物研究所，2000.

Study on production of arabitol from glucose by Hansenula anomala

TANG Xiao-fang1，ZHANG Guo-dong1，*，WANG Gang2
（1.Department of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Sichuan Provincial Food Fermentation Industry Research and Design Institute，Chengdu 611130，China）

Production of D-arabitol from glucose by Hansenula anomala strain GA24 was studied.Some of the influencing factors were determined：aeration，osmotic pressure and medium.The best fermentation conditions were （g/L）：glucose 500，yeast extract 2，peptone 2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；the temperature at 30℃，15～20mL medium contained in 500mL Erlenmeyer flask，and 263h of cultivation.

Hansenula anomala；D-Arabitol；fermentation

TS201.2

A

1002-0306（2012）01-0314-04

2010－12－22 *通訊聯(lián)系人

唐曉芳（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。