益骨化瘀丸定性鑒別方法研究

張曉靜 申小靜

益骨化瘀丸由牛膝(制)、黃芪、骨碎補(bǔ)、大黃(制)、自然銅(制)、女貞子、紅花、甘草等18味藥材組成，為醫(yī)院協(xié)定處方制劑，具有補(bǔ)肝益腎、祛瘀降脂之功效。臨床用于腎虛淤血型股骨頭壞死、各類骨壞死、脊髓壞死、陳舊性骨折等，效果良好。為更快、更好、更簡便地控制其質(zhì)量，采用顯微鑒別和薄層色譜對其進(jìn)行定性鑒別。由于藥材組織具有專屬性等特點(diǎn)，擬對本方骨碎補(bǔ)、大黃、紅花進(jìn)行顯微鑒別，同時對黃芪、大黃、制牛膝進(jìn)行薄層色譜鑒別。

1 儀器與試藥

OLYMPUS顯微鏡;ZF-1型三用紫外分析儀;對照品(中國藥品生物制品檢定所)，益骨化瘀丸(院內(nèi)制劑);所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

2.1.1 紅花的顯微特征 花冠、花絲、柱頭碎片多見，有長管道狀分泌細(xì)胞，常位于導(dǎo)管旁，直徑約至66 μm，含黃棕色至紅棕色分泌物?；ǚ哿ｎ悎A形、橢圓形或橄欖形，直徑約至60 μm，具3個萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起。

2.1.2 甘草的顯微特征 纖維成束，直徑8～14 μm，壁厚，微木化，周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。

2.1.3 大黃的顯微特征 草酸鈣簇晶直徑20～160 μm。淀粉粒甚多，單粒類球形或多角形，直徑3～45 μm，臍點(diǎn)星狀，復(fù)粒由2～8分粒組成。其中大型草酸鈣簇晶最具代表性。草酸鈣簇晶大，直徑20～140 μm。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 黃芪 取本品25 g，研細(xì)，加甲醇50 ml，回流提取1 h，濾過，加甲醇20 ml分3次洗滌藥渣，合并濾液，置水浴上蒸干。殘渣加飽和氯化鈉水溶液30 ml使溶解，用水飽和正丁醇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇液;用氨試液洗滌2次，每次20 ml，棄去水液;正丁醇液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)［1］試驗，吸取上述兩種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)，紫外光燈(365 nm)下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)(結(jié)果見圖1A)。

2.2.2 大黃 取本品6 g，研細(xì)，加甲醇20 ml，回流提取0.5 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 ml，鹽酸1 ml，加熱水解0.5 h，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次10 ml，合并乙醚提取液，揮去乙醚，殘渣加醋酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)［1］試驗，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的5個橙黃色熒光主斑點(diǎn);置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色 (結(jié)果見圖1B)。

2.2.3 牛膝 取本品粉末20 g，加乙醇50 ml，加熱回流40 min，靜置。取上清液10 ml，加鹽酸1 ml，加熱回流1 h后濃縮至約5 ml，加水10 ml，用石油醚(60～90℃)20 ml提取，提取液蒸干，殘渣加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取牛膝對照藥材，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)［1］試驗，吸取供試品溶液10～20 μl，對照藥材溶液10 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇(40∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸試液，在110℃烘約10 min。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)(結(jié)果見圖1 c)。

3 討論

本品處方復(fù)雜，干擾因素較多，經(jīng)反復(fù)試驗，選用了多種展開系統(tǒng)和純化方法，以及樣品的不同取樣量，摸索出處方中大黃、黃芪、牛膝3種藥材的薄層色譜鑒定方法。方法簡便，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，可作為益骨化瘀丸的定性鑒別方法，有效控制其質(zhì)量。

另外，對方中骨碎補(bǔ)、甘草藥材成分也進(jìn)行了薄層定性鑒定研究。

骨碎補(bǔ):取本品粉末6 g，加甲醇50 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。同法制成缺骨碎補(bǔ)的陰性對照樣品溶液。另取柚皮甙對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。以柚皮苷為對照，選用氯仿-醋酸乙酯-甲酸-水(1∶12∶2.5∶3)的上層溶液為展開劑，三氯化鋁試液為顯色劑，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，未顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。故本鑒別不收入正文。

甘草:取本品粉末10 g，加乙醚40 ml，置水浴上加熱回流1 h，濾過，藥渣加甲醇30 ml，置水浴上加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 ml使溶解，水溶液用正丁醇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用水洗滌3次，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材，同法制成對照藥材溶液。同法制成缺甘草的陰性對照樣品溶液。以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(30∶2∶2∶4)為展開劑，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105℃烘至顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，未顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。故本鑒別不收入正文。

此外，對本制劑的定量分析在進(jìn)一步研究中。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010．