新城疫濃縮滅活疫苗的初步研究

李俊平，李啟紅，楊承槐，劉 丹，李慧姣，蔣桃珍，黃建華

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起的一種侵害禽類的急性高度接觸性傳染病，是造成我國養(yǎng)雞業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要病原之一。疫苗免疫是預(yù)防該病的有效手段，目前在我國注冊用于生產(chǎn)ND活疫苗的毒株有低毒力毒株HB1株、La Sota株、Clone30株、VG/GA株、V4/HB92克隆株，滅活疫苗毒株主要是La Sota株。符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的ND疫苗免疫雞后，可以有效保護(hù)ND強(qiáng)毒株的攻擊。近年來，雖然可見有關(guān)NDV基因型的變化及不同基因型致病性差異的報道[1-5]，但尚無可靠的試驗數(shù)據(jù)證明現(xiàn)有疫苗免疫無法保護(hù)某一基因型NDV的攻擊。

常規(guī)雞ND滅活疫苗在生長周期較短的肉用雞中被廣泛使用，這對控制肉雞ND疫病發(fā)揮了重要作用。但由于常規(guī)疫苗使用劑量大，注射部位易出現(xiàn)較重的局部炎癥反應(yīng)或肉雞屠宰時仍有疫苗未能完全吸收，這不僅影響雞肉的品質(zhì)，同時因為疫苗用佐劑為體內(nèi)不可代謝的礦物油，也存在著一定的食品安全隱患。為解決這一問題，本研究對現(xiàn)有滅活疫苗制造規(guī)程進(jìn)行量化并研究了不同濃縮倍數(shù)疫苗的免疫效力，初步優(yōu)化了新城疫濃縮滅活疫苗的最佳生產(chǎn)工藝。該生產(chǎn)工藝不僅大大減少了疫苗的使用劑量，同時疫苗的免疫效力也相應(yīng)提高，有望為肉雞新城疫的有效控制和食品安全提供保障。

1 材料和方法

1.1 病毒株 雞新城疫病毒(La Sota株)，病毒含量為108.5EID50/0.1mL。

1.2 SPF雞胚及SPF雞 由北京實驗動物中心提供，SPF種蛋孵至9～11日齡備用。

1.3 ND抗原增殖條件的優(yōu)化 選用10日齡非免疫雞胚，設(shè)定3個滴度(103.0、104.0和105.0EID50/0.1 mL)的NDV病毒含量用于接種，每個劑量接種非免疫雞胚130～140枚，每胚0.1 mL，接種后不同時間分別收獲死亡和存活的雞胚。測定收獲抗原的EID50、HA和總蛋白。同時設(shè)不接毒組作為對照，收獲尿囊液作HA和總蛋白含量測定。

1.4 抗原濃縮 根據(jù)1.3項試驗結(jié)果確定的ND抗原增殖條件，制備ND抗原?？乖?jīng)離心去沉淀后，采用Millipore公司生產(chǎn)的截留分子量為100 kD的濃縮濾膜對ND抗原進(jìn)行濃縮，分別濃縮至總體積的 1/2、1/3、1/4、1/10，測定濃縮液和濾過液中抗原的EID50、HA和總蛋白。

1.5 不同濃縮倍數(shù)疫苗的免疫效力研究 用10倍濃縮的抗原加PBS配制成了原倍抗原、3倍抗原、5倍抗原和10倍抗原，分別以水相∶油相=1∶2乳化制備4批疫苗。每批疫苗經(jīng)胸部肌肉注射接種4周齡的SPF 雞10 只，14、21、28、35 d 采血測定HI效價。

2 試驗結(jié)果

2.1 ND抗原的增殖條件 分別以103.0EID50、104.0EID50和105.0EID50病毒含量接種10日齡非免疫雞胚，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，雞胚死亡增多，且死亡數(shù)量隨接種劑量的增大而增多(表1)。測定收獲抗原的EID50、HA和總蛋白，結(jié)果見表2。結(jié)果表明103.0EID50和104.0EID50接種組收獲的病毒含量和HA效價較105.0EID50接種組高;抗原中總蛋白含量隨培養(yǎng)時間的增加而增高，但總蛋白含量與病毒含量及HA效價無明顯的相關(guān)性，同期收獲尿囊液中接毒組總蛋白含量低于對照組，可見通過測定總蛋白含量無法可靠衡量抗原含量。

由試驗結(jié)果可確定ND抗原的增殖條件如下:選用10日齡發(fā)育良好的非免疫雞胚，每胚經(jīng)尿囊腔接種0.1 mL(含103.0～104.0EID50)的病毒液。棄60 h內(nèi)死亡雞胚，此后，每4～6 h照蛋1次，隨時取出死亡雞胚，直至96 h，不論死亡與否，全部取出，置于2～8℃冷卻4～24 h，無菌收獲尿囊液。

表1 不同接種劑量雞胚死亡情況

表2 不同接種劑量和收獲時間對收獲抗原的影響

續(xù)表

2.2 抗原濃縮 根據(jù)ND抗原增殖條件的優(yōu)化試驗結(jié)果，制備了約10000 mL的ND抗原，病毒含量為108.5EID50/0.1mL，HA效價為210。將制備的ND 抗原分別濃縮至總體積 1/2、1/3、1/4、1/10，測定濃縮液和濾過液中抗原的EID50、HA和總蛋白，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，100 kD濾膜能有效截留NDV，濃縮倍數(shù)與HA效價及病毒含量成正相關(guān);濾過液中含有部分具有感染性的病毒，但測不到血凝價。收獲的尿囊液中總蛋白濃度與濃縮倍數(shù)相關(guān)性不強(qiáng)。因此可采用HA效價作為濃縮抗原的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。

表3 ND濃縮抗原的HA效價和病毒滴度

2.3 不同濃縮倍數(shù)疫苗的免疫效力 原倍抗原、3倍抗原、5倍抗原和10倍抗原，以水相∶油相=1∶2乳化制備4批疫苗，分別為 ND01、ND03、ND05和ND10。免疫試驗結(jié)果表明，免疫雞的HI抗體效價基本與抗原濃縮倍數(shù)成正相關(guān)，但當(dāng)HA效價達(dá)到一定水平后，免疫雞的HI抗體滴度即保持一定水平而無明顯升高。采用3倍濃縮抗原制備的疫苗，以5 μL的劑量(標(biāo)準(zhǔn)檢驗劑量的1/4)免疫SPF雞，即可達(dá)到合格的抗體效價，并且免疫后35 d效價依然在較高水平，詳細(xì)結(jié)果見表4。

3 討論與小結(jié)

3.1 ND抗原繁殖時接毒劑量的優(yōu)化 《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)(簡稱規(guī)程)[6]中雞新城疫滅活疫苗制造與檢驗規(guī)程中有關(guān)ND抗原制備的接種方法為:取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10-4或10-5)，每胚尿囊內(nèi)接種0.1 mL。規(guī)程中對接毒的病毒含量未做具體要求，對生產(chǎn)者指導(dǎo)性不強(qiáng)。本研究結(jié)果表明每胚經(jīng)尿囊腔接種 0.1 mL(含 103.0～104.0EID50)的病毒液收獲的尿囊液病毒含量高，從而對現(xiàn)有規(guī)程中雞新城疫滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程的接毒劑量進(jìn)行了量化，對ND抗原的生產(chǎn)更具有指導(dǎo)意義。

表4 不同濃縮倍數(shù)疫苗免疫后的HI抗體效價

3.2 ND病毒的濃縮工藝 病毒濃縮是增加疫苗抗原濃度，降低副反應(yīng)，提高免疫效果的有效手段，已在我國獸用疫苗生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，尤其是生產(chǎn)多聯(lián)滅活疫苗時，需對各抗原成分進(jìn)行適當(dāng)濃縮[7]。有關(guān)禽用疫苗病毒濃縮技術(shù)研究，新城疫病毒濃縮工藝研究已有報道[8-9]，但采用的濃縮系統(tǒng)不同，實驗結(jié)果有所差別。本研究在參考文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，小試時選用了3種不同孔徑的濾膜，結(jié)果100 kD濾膜能有效截留NDV，50 kD濾膜可有效截留NDV，但濾過效率低，而300 kD濾膜無法有效截留NDV，所以選用100 kD濾膜濃縮ND抗原。在對濃縮效果評價指標(biāo)方面，病毒含量(EID50)及蛋白含量雖然隨濃縮倍數(shù)的提高而增加，但缺乏良好的線性關(guān)系，而且測定周期相對較長，無法及時準(zhǔn)確評價濃縮效果;HA效價與濃縮倍數(shù)具有良好的正比線性關(guān)系，測定簡單，用時少，能夠及時準(zhǔn)確評價濃縮效果，是確定濃縮效果的可靠指標(biāo)。

3.3 ND病毒抗原濃縮倍數(shù)與免疫效果 3倍濃縮的ND抗原制備的疫苗，以1/4倍效力檢驗用劑量(5 μL)免疫SPF雞，按現(xiàn)有ND滅活疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行效力檢驗，能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，而且抗體在較高水平可以維持5周以上。因此，以ND病毒3倍濃縮的抗原制備的滅活疫苗，小劑量(0.1 mL)免疫1日齡肉雞，有望為飼養(yǎng)周期短的肉雞提供有效的保護(hù)。采用該生產(chǎn)工藝研制肉雞專用ND滅活疫苗，不僅能大大減少疫苗的使用劑量，同時疫苗的免疫效力也會相應(yīng)提高，為肉雞ND的有效控制和食品安全提供保障。

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