徐 鵬 王寧夫 周 亮 葉顯華 童國新 冷建杭

最近有研究報(bào)告，由于吸煙具有促進(jìn)氯吡格雷向活性產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的作用，故吸煙可以使氯吡格雷抑制血小板聚集和活化的作用增強(qiáng)，而且冠心病的預(yù)后也顯著得到改善［1］。對(duì)這些研究結(jié)果的解釋和一些專家的觀點(diǎn)與以往吸煙有害的研究結(jié)論相矛盾，在學(xué)術(shù)界引起關(guān)注和爭論。然而，吸煙作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，其致病作用已得到明確證實(shí)，大量臨床研究顯示吸煙者患冠心病的危險(xiǎn)是不吸煙者的1．5～4.0倍;吸煙者患心肌梗死的危險(xiǎn)是不吸煙者的3倍左右。因此吸煙有益于增加氯吡格雷抑制血小板聚集和活化的結(jié)論有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究旨在驗(yàn)證吸煙是否在冠心病患者冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)后近期有增強(qiáng)氯吡格雷抗血小板活化作用。

對(duì)象與方法

1．入選標(biāo)準(zhǔn):隨機(jī)入選2009年2～10月在筆者醫(yī)院診斷為不穩(wěn)定心絞痛初次擇期行冠脈造影的病人，符合冠脈介入治療(PCI)術(shù)標(biāo)準(zhǔn)并成功地行介入治療的病人分為吸煙組(22例)和非吸煙組(20例)。吸煙組的標(biāo)準(zhǔn):吸煙1年以上并且近24h內(nèi)吸煙，每日超過10支;非吸煙組的標(biāo)準(zhǔn):既往無吸煙史和已經(jīng)戒煙10年以上者。

2．排除標(biāo)準(zhǔn):兩組均排除急性心肌梗死、既往吸煙但已戒煙或雖然未戒煙而近24h內(nèi)未吸煙者、氯吡格雷過敏、過去兩個(gè)月內(nèi)有獻(xiàn)血史、出凝血功能障礙、胃腸道手術(shù)史(闌尾切除術(shù)除外)、肝腎疾病、病毒性肝炎攜帶者、甲狀腺功能亢進(jìn)或減退、腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、有其他動(dòng)、靜脈血栓疾病者及重度心力衰竭(NYHAⅣ級(jí))。

3．服用藥物:所有患者入院后即頓服拜阿司匹林300mg、氯吡格雷300mg，隨后按拜阿司匹林100mg每天1次、氯吡格雷75mg每天1次服用，同時(shí)根據(jù)冠心病治療原則服用他汀、硝酸酯等藥物，有高血壓、糖尿病者繼續(xù)服用相關(guān)藥物;冠脈造影后如需行PCI術(shù)者，術(shù)后繼續(xù)服用氯吡格雷75mg每天1次、拜阿司匹林100mg每天1次。拜阿司匹林100毫克/片，產(chǎn)自德國拜耳公司，氯吡格雷75毫克/片，產(chǎn)自法國賽諾菲－安萬特公司。

4．樣本采集:所有患者入院后即采集外周靜脈血3ml;PCI術(shù)后患者在術(shù)后24、72h早晨空腹再次采集外周靜脈血3ml。將所采集的靜脈血加入3．13%枸櫞酸鈉(CTAD)抗凝管。

5．活化血小板的測(cè)定:熒光抗體染色:采用三色熒光染色，于FALCON試驗(yàn)管中加入 PAC－1－FITC、CD62p－PE、CD61－PerCP抗體各20μl，各管分別加入混勻的全血5μl;在對(duì)照管中加入 PAC－1－FITC、IgG1－PE、CD61－per－cp各20μl及RGDS 10μl。室溫下避光孵育20min，加入2～8℃1%多聚甲醛(PFA)，充分混勻，陰暗處放置，24h內(nèi)上流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。流式細(xì)胞儀(FCM):開機(jī)后以CaliBRITE3熒光微球和FACDComp自動(dòng)軟件檢查儀器靈敏度，并自動(dòng)設(shè)定實(shí)驗(yàn)的獲取條件，包括光電倍增管(PMT)電壓和熒光補(bǔ)償?shù)龋缓笠訡ellQuest軟件用樣本進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲取條件，并檢測(cè)各組樣本管，獲取10000個(gè)細(xì)胞，最后用 CellQuest軟件分析CD61、CD62p陽性顆粒的百分率。所有試劑均由美國BD公司生產(chǎn)，固定液PFA由美國Sigma公司生產(chǎn)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及計(jì)算使用SPSS 16．0完成，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，基線數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗(yàn)，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．基線情況:兩組在年齡、高血壓、高脂血癥、糖尿病、腦血管病及服用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)等方面的差距無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2．服用氯吡格雷前和PCI術(shù)后24、72h的CD61、CD62p改變:服用氯吡格雷前和PCI術(shù)后24、72h的CD61、CD62p的各組數(shù)據(jù)資料見表2。

3．服用氯吡格雷前和PCI術(shù)后24、72h的CD61、CD62p表達(dá)率、差值的比較見表3。數(shù)據(jù)顯示，兩組術(shù)后24、72h的CD61、CD62p陽性表達(dá)率與術(shù)前比較無顯著改變;其中術(shù)后24h兩組的CD61、CD62p表達(dá)較術(shù)前均有下降的趨勢(shì)，但組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;吸煙組在術(shù)后72h的CD61、CD62p表達(dá)較術(shù)前仍有下降趨勢(shì)，而非吸煙組已無下降表現(xiàn)，但是組間比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

討 論

煙草煙霧中的一氧化氮、一氧化碳、氧自由基等物質(zhì)損害血管內(nèi)皮、增加血液黏稠度和血小板聚集、活化的能力、促進(jìn)血栓形成，誘發(fā)或加劇心血管疾病，不論主動(dòng)還是被動(dòng)吸煙者，心血管疾病都明顯增加。吸煙作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，其致病作用已得到明確證實(shí)，但是近期對(duì)一些吸煙與血栓的臨床試驗(yàn)結(jié)果的解釋造成一些學(xué)術(shù)爭論。CLARITY－TIMI 28試驗(yàn)的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷降低了冠脈造影前總體梗死相關(guān)的主要終點(diǎn)事件和病死率，但吸煙≥10支/天者獲益要明顯高于不吸煙者;同樣，氯吡格雷在降低30天全因死亡、心肌梗死和急性血運(yùn)重建方面，吸煙≥10支/天者也優(yōu)于不吸煙者［1］。Jeong等［2］對(duì)138名急性心肌梗死并且進(jìn)行支架置入的患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)每日抽煙≥10支的患者其5和20μmol/L ADP誘導(dǎo)下的血小板聚集率都明顯低于非吸煙者(40．9% ± 16．1%vs 46．6% ± 11.7%，P=0.028，53．8% ± 16．6%vs 59．2% ± 12．2%，P=0.040)，在吸煙的健康志愿者和急性ST段抬高性心肌梗死患者身上發(fā)現(xiàn)氯吡格雷的抗血小板作用有增加的表現(xiàn)。

對(duì)此類研究結(jié)果如何解釋是目前學(xué)術(shù)爭論的焦點(diǎn)。一些作者認(rèn)為吸煙促進(jìn)了氯吡格雷向其活性成分的轉(zhuǎn)化。氯吡格雷屬第2代噻吩吡啶類藥物，其原藥無活性，體內(nèi)經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450轉(zhuǎn)化的代謝物方具抗血小板聚集活性。Yousef等［3］觀察了正常志愿者吸煙對(duì)氯吡格雷藥代動(dòng)力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)相對(duì)非吸煙者，吸煙者的氯吡格雷(原形及無活性羧酸代謝產(chǎn)物)曲線下面積(AUC)下降30%，半衰期下降35%，而血漿峰值濃度和達(dá)峰值濃度的時(shí)間無差異。研究發(fā)現(xiàn)吸煙可以干擾 CYP亞型，誘導(dǎo)CYP1A2、CYP2C19等的表達(dá)，從而促進(jìn)氯吡格雷向活性產(chǎn)物方向的代謝［4，5］。

事實(shí)上，吸煙是否增加氯吡格雷的抗血小板作用，學(xué)術(shù)界也有一定的爭議，Cho等［6］的相關(guān)研究證實(shí)在急性心肌梗死患者中吸煙與血小板活性的降低沒有相關(guān)性，而PCI術(shù)后吸煙≥10支/日的患者氯吡格雷也沒有進(jìn)一步降低血小板活性。

另一種觀點(diǎn)認(rèn)為吸煙本身有急性誘導(dǎo)血小板聚集的作用，氯吡格雷阻斷血小板聚集作用的增強(qiáng)是一種對(duì)吸煙者造成凝血功能失調(diào)的的反應(yīng)，在某種程度上也表明吸煙者與非吸煙者可能在血栓發(fā)生機(jī)制上有所不同，吸煙者更需要氯吡格雷治療。Addad等［7］對(duì)穩(wěn)定型冠心病患者的研究證實(shí)這一觀點(diǎn)。Cucina等［8］研究證實(shí)煙草中的尼古丁可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞表面P2Y12受體的表達(dá)，雖然該實(shí)驗(yàn)沒有直接有關(guān)于血小板的數(shù)據(jù)，因?yàn)檠“逵沙墒斓木藓思?xì)胞脫落而來，故推測(cè)血小板分泌的ADP表面P2Y12受體表達(dá)也因吸煙而增加，從而使氯吡格雷的抗血小板作用增加。

本實(shí)驗(yàn)采用常用的血小板活化標(biāo)志物CD61、CD62p作為觀測(cè)血小板活化程度的指標(biāo)。Cd61是血小板膜糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)代表的CD抗原，與GPIIb構(gòu)成GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物，是血小板含量最多的糖蛋白，研究證實(shí)GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結(jié)合是血小板聚集的最后通路［9］。CD62p是α顆粒膜表面的糖蛋白GMP－140代表的CD抗原，又稱P－選擇素，其在血小板質(zhì)膜上的表達(dá)或其陽性血小板的百分率的增加被認(rèn)為是活化血小板的特異性標(biāo)志物［10］;CD62p的強(qiáng)表達(dá)在血小板活化后10min時(shí)出現(xiàn)，活化有賴于 GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結(jié)合，因此CD62p是血小板活化的晚期標(biāo)志物［11］。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示PCI術(shù)前、術(shù)后兩組間CD61、CD62P的表達(dá)沒有明顯差異，術(shù)后24h的CD61、CD62P的表達(dá)較術(shù)前有所下降(CD61:－1．16% ±19．06%vs －0．98% ±22．19%，P=0．36;CD62p:－ 1．93% ± 10．80%vs－2．07% ±15．49%，P=0．96)，可以認(rèn)為與氯吡格雷的抗血小板作用有關(guān);術(shù)后72h吸煙組的CD61、CD62P的表達(dá)較術(shù)前仍略有下降，非吸煙組則不再降低(CD61:－2．19% ±21.72%vs 5．27% ±26.58%，P=0．46;CD62p:－6．13% ±18.74%vs 0．12% ±12.78%，P=0．25)，兩組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示吸煙未能增強(qiáng)冠心病患者PCI術(shù)后早期氯吡格雷的抗血小板活化作用。

本實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)一步驗(yàn)證CLARITY－TIMI 28等試驗(yàn)的結(jié)論，可能的原因有:①吸煙增強(qiáng)氯吡格雷抗血小板作用，同時(shí)也增加了血小板活化能力，兩者的作用有所抵消;②CLARITY－TIMI 28等試驗(yàn)中未進(jìn)一步明確入院及隨訪過程中的戒煙情況，不良終點(diǎn)事件的減少還可能與戒煙本身有關(guān)，因?yàn)榻K點(diǎn)事件的減少與吸煙的數(shù)量明顯相關(guān);③上文中提到的一些氯吡格雷相關(guān)的試驗(yàn)是在健康志愿者或者體外完成的，且氯吡格雷存在較大的個(gè)體差異性，吸煙對(duì)氯吡格雷抗血小板作用的影響究竟如何，目前尚缺乏大規(guī)模臨床證據(jù)。

因?yàn)槟壳瓣P(guān)于吸煙對(duì)氯吡格雷抗血小板作用方面的實(shí)驗(yàn)不多，而且相關(guān)試驗(yàn)中以CD61、CD62p等標(biāo)志物來測(cè)定血小板作用的報(bào)道較少。由于受樣本偏少、患者合并高血壓等疾病的影響及入院后短期減少或停止吸煙等因素的影響，本研究結(jié)果有一定的局限性。因此，吸煙是否可以增加氯吡格雷的抗血小板作用，還需大樣本的臨床觀察以進(jìn)一步明確。

本實(shí)驗(yàn)表明吸煙的冠心病患者未發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)后早期氯吡格雷的抗血小板活化作用增強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)未能驗(yàn)證吸煙能增加冠心病患者PCI術(shù)后近期氯吡格雷的抗血小板活化作用這一結(jié)論。關(guān)于吸煙者PCI術(shù)后服用氯吡格雷是否有額外臨床獲益的問題，本文未做探討，還需大樣本的臨床觀察以進(jìn)一步澄清。

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